L’alimentation de l’ARNi en culture liquide : une méthode à haut débit pour inhiber l’expression génique chez C. elegans

Résumé

Source : Groh, N. et al. Méthodes pour étudier les changements dans l’agrégation inhérente des protéines avec l’âge chez Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

ARNi est un outil génétique puissant à la disposition des chercheurs de C. elegans. Cette vidéo présente une méthode pour traiter plus de vers avec de l’ARNi que l’alimentation en plaque en utilisant des conditions de culture liquide.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Culture liquide d’animaux sans gonades pour collecter des animaux jeunes et âgés soumis à l’ARNi ciblant un gène d’intérêt

NOTE : La réponse de certains gènes à l’ARNi peut dépendre de la température, comme décrit précédemment. Comme alternative à l’ARNi, un gène mutant pourrait être incorporé dans le fond gon-2(-).

1. Préparation de bactéries pour la culture liquide
   1. Préparez les bactéries OP50 et ARNi (bactéries produisant l’ARNdb souhaité et bactéries avec le vecteur vide comme témoin) en inoculant un milieu de 4 L LB avec 12 ml de la culture bactérienne respective (ajoutez une concentration finale de 50 μg/mL de carbénicilline et 1 mM d’IPTG aux cultures bactériennes ARNi) et incubez-les à 37 °C pendant la nuit à 180 tr/min.
   2. Le lendemain, récoltez les cultures à 6 700 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez les surnageants et remettez en suspension chaque pastille dans 60 mL de milieu de base S glacé (100 mM de NaCl, 50 mM de phosphate de potassium pH 6, conservés sur glace). Conservez les trois pastilles remises en suspension (OP50, bactéries ARNi témoins et bactéries ARNi pour le gène d’intérêt) à 4 °C jusqu’à l’étape 1.2.
      REMARQUE : Les vers peuvent être cultivés sur l’ARNi à partir du stade L1 ou pour éviter les défauts de développement à partir du dernier stade larvaire L4 (voir étape 1.2).
2. Culture liquide pour le traitement par ARNi à partir du dernier stade larvaire L4
   1. Ajouter 200 mL de milieu basal S dans une fiole de culture Fernbach (capacité 2 800 mL). Pour un volume de culture final de 300 mL (voir 1.2.2.4), ajouter 10 mM de citrate de potassium, pH 6, 3 mL de solution d’oligo-métaux (5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM de MgSO₄, 3 mM de CaCl₂, 100 ng/mL de carbendazime et 5 μg/mL de cholestérol). Fermez le ballon à l’aide d’un bouchon à vis à membrane. Reportez-vous au Tableau 1 pour les recettes de tampons.
   2. Sortez les L1 de 25 °C et transférez-les dans des tubes de 15 ml. Centrifugez à 1 900 x g pendant 3 min, retirez le surnageant et comptez les L1 par 2 μL. Ajoutez 500 000 L1 dans le ballon de culture Fernbach préparé à l’étape précédente.
   3. Ajoutez OP50 (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers. Par exemple, pour 500 000 vers, ajoutez 60 mL d’OP50.
   4. Compléter la culture de vers avec du S basal pour porter le volume total à 300 mL. Incuber la culture de vers jusqu’au stade L4 à 25 °C dans un incubateur à agitation à 150 tr/min.
   5. Le lendemain, les vers devraient avoir la taille de L4 de type sauvage. Pour passer des bactéries OP50 aux bactéries ARNi, rassemblez les animaux dans six tubes de 50 ml, laissez-les sédimenter et retirez le surnageant. Lavez les L4 avec M9 pour éliminer les bactéries OP50 résiduelles : centrifugez à 1900 x g pendant 3 min, retirez le surnageant et transférez tous les L4 dans un tube de 50 mL. Comptez les L4 par 5 μL (au moins neuf fois). Deux fois 50 000 L4 sont nécessaires pour la collection de jeunes vers et deux fois 100 000 L4 sont nécessaires pour la collection de vers âgés.
   6. Préparez quatre flacons de culture Fernbach comme décrit à la section 1.2.2.1. Ajouter également une concentration finale de 50 μg/mL de carbenicilline et 1 mM d’IPTG dans chaque flacon.
   7. Ajouter les bactéries ARNi et les bactéries ARNi témoins pour le gène d’intérêt (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers : Ajouter 7 ml des bactéries respectives par flacon pour les jeunes vers et 14 ml par ballon pour les vers âgés.
   8. Ajouter 50 000 vers par flacon pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers par flacon pour la collection de vers âgés, et compléter les cultures avec du S basal pour remplir jusqu’à 300 ml. Incuber les cultures de vers (quatre au total) à 25 °C et 150 tr/min.

2. Entretien des cultures liquides de C. elegans

1. Prélever périodiquement une aliquote de chaque culture liquide et la placer sur une lame de verre (ou sur une plaque de gélose) pour vérifier qu’il n’y a pas de contamination. À l’aide d’un microscope de dissection, vérifiez les niveaux de nourriture bactérienne dans la culture, en particulier pendant la phase de croissance. Préparez à l’avance 2 L de bactéries ARNi et de bactéries ARNi témoins pour le gène d’intérêt, comme décrit à l’étape 1.1. Ajoutez-les à des cultures liquides de C. elegans si nécessaire et maintenez le reste à 4 °C.
2. Vérifiez périodiquement que les animaux sont stériles. La majorité des animaux n’auront pas de gonade. En fonction de la pénétrance de la mutation gon-2, certains peuvent avoir des structures gonadiques avortées mais aucun animal avec des œufs ne doit être observé.

Solution mère	quantité	Concentration finale	Commentaires/Description
S basal (pour 500 ml : 5,9 g de NaCl, 50 mL 1 M Phosphate de potassium pH 6)	200 ml		1 M Phosphate de potassium pH 6 : Pour 1 L : 129 g KH2PO4 monobasique, 52 g de K2HPO4 dibasique anhydre
1 M de citrate de potassium pH 6 (Pour 400 ml : 13,1 g d’acide citrique monohydraté, 134,4 g de citrate tripotassique monohydraté)	3 ml	10 millions d’euros
Solution de métaux traces (Pour 1 L : 1,86 g d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Conserver la solution mère dans l’obscurité à 4 °C
1 M MgSO4 (pour 500 ml : 123,3 g)	900 μL	3 millions d’euros
1 M de CaCl2 (pour 500 ml : 73,5 g)	900 μL	3 millions d’euros
200 μg/mL de carbendazime (Pour 50 ml : 10 mg dans du méthanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL de cholestérol (Pour 100 ml : 0,5 g dans de l’éthanol)	300 μL	5 μg/mL

Table 1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fiole de culture Fernbach	Corning	Réf. 4425-2XL	Pyrex, capacité 2 800 ml, avec 3 déflecteurs	oui
Bouchon à vis à membrane	Schott	1E+06	GL45	oui
Mélangeur à nutation	VWR	444-0148		oui
Entonnoir séparateur	Nalgene	4300-1000	Contenance 1 000 ml	Non
Seringue de 1 ml	BD Plastipak	3E+05		Non
Aiguille grise, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05		Non
Filtres à membrane 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		Non
Bandelette de pH	Machery-Nagel	Référence 92110	pH-Fix 0-14	Non
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	5E+09	Tablettes complètes Mini sans EDTA	Non
L’octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100	Non
Acide 4-morpholinéthanesulfonique (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		Non
Nonylphénylpolyéthylèneglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)	Non
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, sans RNase	Non
RNaseA	Promega	A7973	solution	Non
Coloration par transfert de protéines totales	Thermopêcheur	Réf. S11791	Coloration de la protéine Sypro Ruby	Non
Coloration du gel de protéines totales	Thermopêcheur	S12001	Coloration au gel de protéines Sypro Ruby	Non
PTCE (chlorhydrate de tris (2-carboxyéthyl)phosphine)	Serva	Référence 36970		Non
Iodoacétamide	Serva	Référence 26710		Non
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	Référence 9830		Non
Séquençage de la trypsine modifiée	Promega	Réf. V5111		Non
Balises isobares pour la quantification relative et absolue	Sciex	4E+06	Kit multiplex de réactifs iTRAQ	Non
Centrifugeuse Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		oui
Ultracentrifugeuse Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		Non
Centrifugeuse 5424R	Eppendorf	5E+09		oui
Centrifugeuse 5702	Eppendorf	6E+09		oui
Centrifugeuse Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07		Non
Concentrateur Plus	Eppendorf	5E+09	Évaporateur centrifuge	Non
Stéréomicroscope fluorescent M165 FC	Leica		Avec objectif Planapo 2.0x	Non
Microscope de dissection	Leica		Leica S6E	oui
Microscope à fort grossissement Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Avec objectif PlanAPOCHROMAT 20x et Zeiss Axio Cam MRm	Non
logiciel				Non
Logiciel d’analyse d’images	ImageJ			Non
Analyse des données de spectrométrie de masse	Prospecteur de protéines		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Non
souches d’E. coli
OP50	La
Bactéries ARNi
L4440	Bibliothèque d’ARNi de Julie Ahringer
C. elegans mutants
Référence CF2253	CGC, nom de la souche : EJ1158		Génotype : gon-2(q388)
C. elegans transgéniques
DCD214	Le laboratoire de Della David à DZNE Tübingen		Génotype : N2 ; uqIs24[Pmyo-2 ::tagrfp ::p ab-1]
DCD215	Le laboratoire de Della David à DZNE Tübingen		Génotype : daf-2(e1370) III ; uqIs24[Pmyo-2 ::tagrfp ::p ab-1]