L’alimentation de l’ARNi en culture liquide : une méthode à haut débit pour inhiber l’expression génique chez C. elegans

Ce protocole est un extrait de Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Culture liquide d’animaux sans gonades pour collecter des animaux jeunes et âgés soumis à l’ARNi ciblant un gène d’intérêt

NOTE : La réponse de certains gènes à l’ARNi peut dépendre de la température, comme décrit précédemment. Comme alternative à l’ARNi, un gène mutant pourrait être incorporé dans le fond gon-2(-).

1. Préparation de bactéries pour la culture liquide
   1. Préparez les bactéries OP50 et ARNi (bactéries produisant l’ARNdb souhaité et bactéries avec le vecteur vide comme témoin) en inoculant un milieu de 4 L LB avec 12 ml de la culture bactérienne respective (ajoutez une concentration finale de 50 μg/mL de carbénicilline et 1 mM d’IPTG aux cultures bactériennes ARNi) et incubez-les à 37 °C pendant la nuit à 180 tr/min.
   2. Le lendemain, récoltez les cultures à 6 700 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez les surnageants et remettez en suspension chaque pastille dans 60 mL de milieu de base S glacé (100 mM de NaCl, 50 mM de phosphate de potassium pH 6, conservés sur glace). Conservez les trois pastilles remises en suspension (OP50, bactéries ARNi témoins et bactéries ARNi pour le gène d’intérêt) à 4 °C jusqu’à l’étape 1.2.
      REMARQUE : Les vers peuvent être cultivés sur l’ARNi à partir du stade L1 ou pour éviter les défauts de développement à partir du dernier stade larvaire L4 (voir étape 1.2).
2. Culture liquide pour le traitement par ARNi à partir du dernier stade larvaire L4
   1. Ajouter 200 mL de milieu basal S dans une fiole de culture Fernbach (capacité 2 800 mL). Pour un volume de culture final de 300 mL (voir 1.2.2.4), ajouter 10 mM de citrate de potassium, pH 6, 3 mL de solution d’oligo-métaux (5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM de MgSO₄, 3 mM de CaCl₂, 100 ng/mL de carbendazime et 5 μg/mL de cholestérol). Fermez le ballon à l’aide d’un bouchon à vis à membrane. Reportez-vous au Tableau 1 pour les recettes de tampons.
   2. Sortez les L1 de 25 °C et transférez-les dans des tubes de 15 ml. Centrifugez à 1 900 x g pendant 3 min, retirez le surnageant et comptez les L1 par 2 μL. Ajoutez 500 000 L1 dans le ballon de culture Fernbach préparé à l’étape précédente.
   3. Ajoutez OP50 (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers. Par exemple, pour 500 000 vers, ajoutez 60 mL d’OP50.
   4. Compléter la culture de vers avec du S basal pour porter le volume total à 300 mL. Incuber la culture de vers jusqu’au stade L4 à 25 °C dans un incubateur à agitation à 150 tr/min.
   5. Le lendemain, les vers devraient avoir la taille de L4 de type sauvage. Pour passer des bactéries OP50 aux bactéries ARNi, rassemblez les animaux dans six tubes de 50 ml, laissez-les sédimenter et retirez le surnageant. Lavez les L4 avec M9 pour éliminer les bactéries OP50 résiduelles : centrifugez à 1900 x g pendant 3 min, retirez le surnageant et transférez tous les L4 dans un tube de 50 mL. Comptez les L4 par 5 μL (au moins neuf fois). Deux fois 50 000 L4 sont nécessaires pour la collection de jeunes vers et deux fois 100 000 L4 sont nécessaires pour la collection de vers âgés.
   6. Préparez quatre flacons de culture Fernbach comme décrit à la section 1.2.2.1. Ajouter également une concentration finale de 50 μg/mL de carbenicilline et 1 mM d’IPTG dans chaque flacon.
   7. Ajouter les bactéries ARNi et les bactéries ARNi témoins pour le gène d’intérêt (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers : Ajouter 7 ml des bactéries respectives par flacon pour les jeunes vers et 14 ml par ballon pour les vers âgés.
   8. Ajouter 50 000 vers par flacon pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers par flacon pour la collection de vers âgés, et compléter les cultures avec du S basal pour remplir jusqu’à 300 ml. Incuber les cultures de vers (quatre au total) à 25 °C et 150 tr/min.

2. Entretien des cultures liquides de C. elegans

1. Prélever périodiquement une aliquote de chaque culture liquide et la placer sur une lame de verre (ou sur une plaque de gélose) pour vérifier qu’il n’y a pas de contamination. À l’aide d’un microscope de dissection, vérifiez les niveaux de nourriture bactérienne dans la culture, en particulier pendant la phase de croissance. Préparez à l’avance 2 L de bactéries ARNi et de bactéries ARNi témoins pour le gène d’intérêt, comme décrit à l’étape 1.1. Ajoutez-les à des cultures liquides de C. elegans si nécessaire et maintenez le reste à 4 °C.
2. Vérifiez périodiquement que les animaux sont stériles. La majorité des animaux n’auront pas de gonade. En fonction de la pénétrance de la mutation gon-2, certains peuvent avoir des structures gonadiques avortées mais aucun animal avec des œufs ne doit être observé.

Table 1.