Dosage de l’olfactomètre à quatre voies : une méthode pour évaluer les réponses des signaux odorants chez la drosophile

Résumé

Source : Lin, C.C., et al. Comportements olfactifs testés par le suivi informatique de la drosophile dans un olfactomètre à quatre quadrants. J. Vis. Exp. (2016).

Les mouches des fruits ont un système olfactif complexe, peuvent discriminer des centaines d’odorants et utiliser leur odorat pour orienter les décisions comportementales. Cette vidéo décrit le test de l’olfactomètre à quatre voies, une méthode permettant d’étudier les réponses comportementales olfactives chez les mouches. Le clip de protocole présenté montre comment manipuler les mouches de test et quelles sont les étapes critiques lors de la réalisation du test.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Réponses comportementales aux odeurs attrayantes et répulsives

1. Allumez le régulateur de température et réglez-le sur 25 °C.
2. Connectez les chambres odorisantes (contrôle et test des odorisants) en insérant le tube à la sortie de la chambre odorante et au raccord push-to-connect sur la boîte de comportement.
3. Vérifiez le débit dans chaque quadrant à l’aide du débitmètre pour vous assurer que les courants d’air de contrôle et d’odorisant sont égaux à 100 ml/min.
4. Nettoyez l’arène en PTFE et les plaques de verre avec de l’éthanol à 70 % 2-3 fois et laissez-les sécher complètement à l’air libre (~3-4 min).
5. Fixez les plaques de verre à l’arène à l’aide de pinces.
6. Transférez les mouches sans anesthésie au CO₂ dans l’arène par le trou pratiqué dans l’une des plaques de verre. Après le transfert, placez un grillage circulaire sur le trou pour éviter que les mouches ne s’échappent.
   REMARQUE : Il a été démontré que l’anesthésie au CO₂ affecte le comportement de la drosophile et ne doit pas être utilisée dans les 24 heures suivant une expérience comportementale.
7. Placez l’arène avec les mouches dans la chambre étanche à la lumière, connectez les quatre flux d’air de contrôle en connectant le tube fixé au raccord push-to-connect sur la boîte de comportement aux coins de l’arène, fermez la porte de la chambre et attendez 10-15 min pour laisser les mouches s’acclimater au nouvel environnement. Si possible, éteignez les lumières dans la pièce où les expériences sont réalisées, afin d’éviter une éventuelle fuite de lumière minimale qui pourrait biaiser le résultat de l’expérience.
8. Effectuez une expérience de contrôle de 5 à 10 minutes, dans laquelle les mouches sont exposées à 4 courants d’air de contrôle.
9. Analysez les données immédiatement (voir la section Analyse des données ci-dessous) pour vous assurer que les mouches sont réparties uniformément dans l’arène et que l’indice d’attraction est proche de 0. Cette étape est essentielle, car elle permet de vérifier qu’il n’y a pas de sources incontrôlées de préférence ou d’évitement dans l’arène (par exemple, fuite de lumière de l’extérieur, distribution inégale de la température, arène inégale, contamination par les odeurs, etc.). Si les mouches sont réparties de manière inégale ou si leur activité locomotrice est faible, jetez-les, nettoyez à nouveau l’arène (étape 1.4) et utilisez un nouveau lot de mouches pour répéter l’expérience.
10. Connectez la chambre de test d’odorisant à la configuration en allumant les vannes à 3 voies ou en rebouchant les tubes de connexion.
11. Exécutez l’expérience de test pendant 5 à 10 minutes et analysez les données comme indiqué dans la section 2 ci-dessous (Figure 1). Les enregistrements de plus de 20 minutes peuvent générer des fichiers de données difficiles à traiter par ordinateur. Si vous souhaitez des enregistrements expérimentaux plus longs, arrêtez et redémarrez rapidement le programme de suivi. Il en résulte un écart de ~10 secondes entre les enregistrements expérimentaux.
12. Jetez les mouches.
13. Nettoyez l’arène et les plaques de verre avec de l’éthanol à 70 % (étape 1.4) et remplacez les tubes de connexion dans le boîtier étanche à la lumière. Pour accélérer les expériences, une nouvelle arène propre peut être utilisée et l’arène sale nettoyée pendant les exécutions expérimentales.
14. Effectuez une autre expérience avec un nouveau lot de mouches, si nécessaire. Si plusieurs expériences sont menées le même jour, faites très attention à ce qu’il ne reste pas d’odorisant dans le système lors d’un test précédent. Ce n’est normalement pas un problème avec de faibles concentrations d’odorants ou avec du CO₂, mais pour des stimuli très concentrés, un intervalle allant jusqu’à 24 heures entre les essais peut être nécessaire. De plus, tous les tubes après les tubes d’écoulement peuvent être remplacés si une contamination par des odeurs est suspectée lors d’expériences de contrôle. Laissez toujours l’air sec entre les expériences pour rincer continuellement le système.

2. Analyse des données

REMARQUE : Le logiciel d’acquisition de suivi des mouches suggéré (détaillé dans Matériaux), suit les mouches en temps réel pendant l’acquisition, et enregistre l’horodatage et les coordonnées de toutes les mouches détectées au format *.dat. Nous avons développé une routine Matlab sur mesure pour convertir les données dans un format Matlab et les analyser. Des exemples de code sont fournis dans les documents supplémentaires, mais les détails de la mise en œuvre dépendront du logiciel utilisé pour l’acquisition des données.

1. Chargez les données brutes. Créez un masque spatial qui suit les contours de l’arène et appliquez-le aux données brutes pour supprimer tous les points de données qui se trouvent à l’extérieur de l’arène car ils représentent du bruit (Figure 2A, Supplementary Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Supprimez tous les points de données qui se déplacent à une vitesse inférieure à 0,163 cm/s pendant plus de 3 s, car ces données sont susceptibles d’être du bruit ou générées par des mouches immobiles (Figure 2B, Supplementary Code TemporalFiltering.m).
3. Visualisez les points de données restants en les traçant tous en une seule fois ou sous forme de trajectoires uniques (Figure 1, Code supplémentaire SingleTrajectoryViewer.m).
   REMARQUE : L’emplacement des limites d’odeur dans le champ quatre dépend probablement d’un certain nombre de facteurs, tels que les caractéristiques de chaque odorisant et les débits d’air utilisés. Par exemple, les odorisants très volatils rempliront probablement le quadrant des odeurs plus complètement que les odorants moins volatils. Ainsi, il est probable que chaque odorant puisse présenter des limites d’odeur légèrement différentes. L’utilisation d’un détecteur à photoionisation pour mesurer les limites d’odeurs peut être problématique car il utilise un vide pour échantillonner l’air d’un endroit particulier, ce qui perturbe la concentration d’odorant à cet endroit. Néanmoins, les limites d’odeur peuvent être rapidement estimées sur la base des données comportementales des mouches. Par exemple, une limite d’odeur basée sur les traces de mouche cumulées en réponse à différentes odeurs peut être clairement observée dans Figure 1C et 1D.
4. Calculer un indice d’attraction pour déterminer si les expériences de contrôle ne génèrent aucune réponse de préférence, et aussi pour accéder à la réponse à un stimulus odorant (ou optogénétique). Pour calculer un indice d’attraction (IA), utilisez les 5 dernières minutes d’un enregistrement de contrôle ou de test. Pour obtenir une mesure de l’attraction comprise entre +1 (attraction absolue) et -1 (répulsion absolue), la formule suivante est utilisée pour calculer l’IA :
   
   où N_test est le nombre de points de données dans le quadrant de test, N_contrôle est le nombre moyen de points de données dans les trois quadrants de contrôle. Cette mesure est intuitive car aucune préférence ne serait indiquée par des valeurs proches de zéro. Cependant, il n’indique pas correctement la proportion du nombre total de mouches qui se trouvent dans le quadrant odorant. Pour obtenir cette mesure, un indice de pourcentage (IP) peut être utilisé :
   
   où N_test est le nombre de points de données dans le quadrant de test, et N_total est le nombre total de points de données dans les quatre quadrants. Cette formule fournit une mesure qui se situe entre 0 et 1, 0,25 correspondant à l’absence de préférence comportementale (Figure 1E et 2C, Supplementary Code AttractionIndex.m).
5. Exécutez 5 à 10 répétitions de chaque condition expérimentale, en utilisant un nouveau groupe de mouches pour chaque répétition. Comparez les indices d’attraction entre les conditions ou par rapport aux témoins en utilisant le test non paramétrique de Kolmogorov-Smirnov (Figure 1F, fonction kstest2 dans Matlab).

Résultats

Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Fichier de code supplémentaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système de distribution d’air			(Quantité nécessaire)
Tubes et connecteurs
Collecteurs thermoplastiques NPT(F)	Cole-Parmer, IL, États-Unis	Réf. R-31522-31	1
Mamelon réducteur hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5232T314	1
Tubes (ID :1/8)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5108K43	50 Pieds
Tubes (ID :1/16)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 52355K41	100 Pieds
Raccords de tubes cannelés	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5117K71	1 paquet
Raccords de tube à raccorder par pression	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5779K102	4
Raccords de tubes cannelés (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5463K439	1 paquet (10)
Raccords de tubes barbelés (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5463K438	Paquet de 2 (10)
Raccords de tubes barbelés (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5463K4	Paquet de 2 (10)
Raccords de tubes barbelés (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 5670K84	1
Bouchon à tête hexagonale	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 48335K152	1
Régulateur de pression d’air, filtre à air et débitmètres			(Quantité nécessaire)
Unité de séchage de gaz de labatory	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, ÉTATS-UNIS	Modèle : L68-NP-303 ; stock #26840	1
Cadres multitubes pour tubes d’écoulement de 150 mm	Cole-Parmer, IL, États-Unis	Référence R03215-30	1
Cadres multitubes pour tubes d’écoulement de 150 mm	Cole-Parmer, IL, États-Unis	Référence R03215-76	1
Tubes d’écoulement de 150 mm	Cole-Parmer, IL, États-Unis	Réf. R-03217-15	9
Cartouche de valve	Cole-Parmer, IL, États-Unis	Réf. R-03218-72	9
Régulateur d’air de précision	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 6162K13	1
Électrovannes	Automate Scientific, Berkeley, Californie	02-10i	4
Régulateur d’électrovanne	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, Californie	18-janv.	1
Débitmètre électronique	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) et un	National Instruments	NI USB-6009	1
alimentation	Extech Instruments	Référence 382200	1
Chambres à odeurs
Pot en polypropylène à large ouverture 2 oz ; 60 ml	Nalgene	Référence 562118-0002	Au moins 5 sont nécessaires par expérience, mais une chambre séparée est nécessaire pour chaque dillution de chaque odorant. Disponible chez Container Store, pièce #635114)
Chambre d’odorat en verre, 0,25 oz	Bouteille Sunburst	LB4B	Au moins 5 sont nécessaires par expérience
Vanne « In » pour chambre d’odeur	Smart Products, Inc., CA, États-Unis	Référence 214224PB-0011S000-4074	1 de ces pièces est utilisée par chambre d’odeur, mais elles doivent être remplacées fréquemment
Valve « Out » pour chambre d’odeur	Smart Products, Inc., CA, États-Unis	Référence 224214PB-0011S000-4074	1 de ces pièces est utilisée par chambre d’odeur, mais elles doivent être remplacées fréquemment
Joint torique	RT Dygert International, MN, États-Unis	AS568-029 Buna-N O-R	1 paquet (100)
Arène de vol, caméra et boîtes de comportement			(Quantité nécessaire)
Comportement et matériau de la boîte de caméra	Plastiques interétatiques, CA, États-Unis	ABS noir extrudé (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 pouces carrés
Téflon pour manège à mouches et inserts de chambre à odeurs, 3/8 » d’épaisseur, 12 » x 12 »	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 8545K27	1
Plaques de verre, 1/8 » d’épaisseur, 9 » x 9 »	McMaster-Carr, IL, États-Unis	Référence 8476K191	deux
Contrôleur thermoélectrique à double action	WAtronix Inc, Californie, États-Unis	DA12V-K-0	1
Réseau de LED IR	Advanced Illumination, Rochester, VT, États-Unis	AL4554-88024, PS24-TL	2 matrices de LED et une alimentation
Unité de climatisation	Boutique Melcor	MAA280T-12	1
Système d’imagerie			(Quantité nécessaire)
Objectif Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 mm F/1,4) à monture C	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, ÉTATS-UNIS	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Câble d’interconnexion	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, ÉTATS-UNIS	SOCCXC12P05N	1
Adaptateur de caméra DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, ÉTATS-UNIS	SODC700	1
B+W 40,5 093 Filtre IR	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, ÉTATS-UNIS	Référence 65-072442	1
TiFFEN 40,5 mm Polariseur circulaire	amazone		1
Caméra vidéo IR	Industrial Vision Source, Floride, États-Unis	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
Convertisseur vidéo USB	The Imagingsource, Caroline du Nord, États-Unis	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (logiciel de suivi des mouches)	Julian Brown, Stanford, Calfornie : julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
Logiciel IC Capture	The Imagingsource, Caroline du Nord, États-Unis	(http://www.theimagingsource.com/)
divers			(Quantité nécessaire)
Outil rotatif Dremel	Dremel, Racine, WI, États-Unis	Dremel 8000-03	1
Forets diamantés pour la découpe du verre	Disponible auprès de divers fournisseurs ; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1