drosophile Essai du labyrinthe en Y : une méthode pour évaluer les réponses olfactives chez les mouches

Résumé

Source : Simonnet, M. M., et al. Test de l’olfaction de la drosophile avec un test de labyrinthe en Y. J. Vis. Exp. (2014).

Cette vidéo décrit une méthode pour tester le comportement olfactif exploratoire chez la mouche des fruits, appelée le labyrinthe en Y. Le clip de protocole présenté montre comment configurer et effectuer le test.

Protocole

Ce texte de protocole est un extrait de Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Avant de commencer

1. Utiliser une crosse de référence isogénéisée portant des phénotypes comportementaux stables et robustes. Il n’y a pas de règle générale pour choisir ce stock, car tous les témoins potentiels peuvent porter des allèles de fond hétérogènes.
2. Utilisez cette souche témoin pour rétrocroiser toutes les autres crosses nécessaires pour les étapes ultérieures. Cette étape de rétrocroisement est généralement représentée par au moins 5 croisements successifs d’une seule femelle vierge (pour permettre un éventuel croisement entre chromosomes homologues) avec 2 à 3 mâles isogéniques de référence. Cette étape est importante pour homogénéiser le patrimoine génétique entre les différents stocks de mouches.
3. Maintenir les stocks de drosophile sur une farine de maïs standard (9 %), de la levure (10 %) et un milieu gélosé (1,5 %) complétés par un antibiotique (0,4 % de para-hydroxy-benzoate de méthyle) dans un cycle lumière/obscurité de 12 heures à 25 °C.
4. Réaliser des expériences chimiosensorielles dans une pièce à température contrôlée (25 °C) sous une lumière rouge lointaine (pour éliminer la contribution des repères visuels et se concentrer sur les signaux chimiosensoriels). Renouvelez régulièrement l’air de la pièce pour aérer la zone entre chaque expérience.

2. Réponse olfactive à l’aide d’un test de labyrinthe en Y

1. Affamez les mouches pendant 16 à 18 heures à 25 °C dans des tubes en verre contenant une serviette en papier humide avant de tester.
2. Joignez un connecteur en forme de Y à deux flacons en verre et à un flacon en plastique plus petit (flacon de chargement). Utilisez des pointes de pipette de 1 ml qui passent à travers les bouchons en mousse pour relier le connecteur aux trois flacons, et pour obtenir un labyrinthe en Y hermétiquement fermé. Coupez les extrémités étroites de deux pointes de pipette (~2 mm de diamètre, pour éviter tout retour de la mouche une fois qu’elle a pris sa décision) pour former deux flacons « pièges », et une grande extrémité d’une pointe de pipette pour former le tube de « chargement » (Figure 1A).
3. Juste avant de connecter les flacons « pièges » (Figure 1B), placez un papier filtre de ~6 mm de diamètre dans chaque flacon. Ajouter 40 μl de solution odorante sur un papier filtre et 40 μl du solvant correspondant sur le deuxième papier filtre.
4. Introduisez dix mouches de 4 à 9 jours dans le flacon de « chargement ». N’utilisez pas d’anesthésie au CO₂ pendant ce transfert, car elle a un effet important sur le comportement. Utilisez plutôt un bref refroidissement sur de la glace. Une bonne manipulation des mouches anesthésiées est importante pour limiter au maximum le stress sur les sujets.
   1. Effectuez une série de tests de labyrinthe en Y à 25 °C sous une lumière rouge lointaine (en utilisant des ampoules LED pour limiter une éventuelle source de chaleur) afin d’éviter autant que possible les stimuli visuels. Attention à bien alterner les orientations des labyrinthes en Y (tube contenant de l’odorant à gauche, ou à droite, et tube de chargement à l’avant ou à l’arrière ; Figure 1C).
   2. Attendez plusieurs heures pour que les mouches pénètrent dans le flacon du piège contenant l’odorant ou le solvant. Compter les mouches après 24 heures pour augmenter la participation jusqu’à plus de 80 % et fournir la valeur maximale de l’indice olfactif (Simonnet, communication personnelle).
   3. Calculez l’indice olfactif résultant à l’aide de la formule suivante : (nombre dans le tube odorant - nombre dans le tube de solvant)/nombre total de mouches chargées.
5. Lavez l’installation du labyrinthe en Y comme suit : faites tremper l’installation démontée dans RBS 35 MD pendant la nuit. Rincez abondamment à l’eau du robinet. Enfin, rincez à l’eau déminéralisée et laissez sécher.

3. Analyse statistique des données

1. Effectuez un test t, une ANOVA unidirectionnelle ou une ANOVA bifactorielle en fonction des données et des variables.

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube en polystyrène drosophile	VWR europe	Tél. : 734-2255	Labyrinthe en Y de 30 x 25 mm
Tube de drosophile borosilicate	Dijon verre		Labyrinthe en Y de 95 x 25 mm
Bouchon en mousse	Dutscher	999038	Labyrinthe en Y
Connecteur en forme de Y	Europrix	11020605	Labyrinthe en Y
Pointes de pipette de 100 à 1 000 μl	Corning	N° 4868	Joignez les pointes de pipette suivantes au connecteur en forme de Y. Coupez 2 pointes de pipette à 65 mm de l’extrémité large et connectez l’extrémité étroite (avec une ouverture de ~2 mm) à 2 flacons de test. Ces ouvertures limiteront les demi-tours une fois que les mouches entreront dans les tubes contenant les odeurs. Coupez 1 pointe de pipette à 35 mm de l’extrémité large et connectez-la au flacon de chargement.
Ampoule LED rouge lointain	Rubin-Lacaque	Référence 0RB180238	625 à 630 milles marins
acide acétique	Sigma-Aldrich	Référence 45725
Acide phénylacétique	Sigma-Aldrich	Réf. P16621
levure	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Maïs	Eurogerm	Farine de maïs
agar-agar	Kalys	HP-697-25
Benzoate de méthylhydroxy 4	VWR international	25605293