Ce protocole est un extrait de Brust-Mascher et Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).
Recettes :
Assiettes de jus de raisin :
- 5,5 g de gélose bacto
- 14,5 g de dextrose ou de glucose
- 7,15 g de saccharose
- 45 ml de concentré de jus de raisin (100 % jus).
- 204,5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
Mélanger tous les ingrédients et cuire au micro-ondes jusqu’à ébullition.
Ajouter 2,8 ml de mélange d’acide (mélange d’acide : 20,9 ml d’acide propionique, 2,1 ml d’acide phosphorique, 27 ml H20)
Mélanger et verser sur des boîtes de Pétri de 35 mm. Laisser solidifier à température ambiante pendant un ou deux jours. Si les plaques ne sont pas utilisées prochainement, sceller avec du parafilm et les maintenir à 4 °C (laisser équilibrer sur RT avant utilisation).
Pâte de levure :
Dissoudre environ une cuillère à café de levure (Sigma YSC2, levure de Saccharomyces cerevisiae type II) dans l’eau pour former une pâte épaisse. Placez une petite quantité de ceci sur chaque assiette de jus de raisin juste avant de l’utiliser.
Tampon d’injection :
- 150 mM d’aspartate de potassium
- 10 mM de phosphate de potassium
- 20 mM d’imidazole, pH 7,2
Colle heptane :
Déroulez le double ruban adhésif et placez-le dans une bouteille de 100 ml, ajoutez environ 50 ml d’heptane, fermez la bouteille et bercez-la pendant plusieurs jours. Lors de l’utilisation, ajoutez de l’heptane si la colle est trop épaisse.
Chambre de déshydratation :
Prenez une boîte de Pétri de 100 mm, mettez une partie d’une boîte de 35 mm à l’intérieur pour faire une « table » et ajoutez de la drierite (sulfate de calcium anhydre) autour de celle-ci afin que la hauteur de la drierite ne soit pas supérieure à la « table » et couvrez. La lamelle avec les embryons sera placée sur cette « table » pour la déshydratation avant l’injection. C’est une bonne idée d’utiliser au moins un peu de drierite indicatrice et de la changer lorsqu’elle a changé de couleur.
Protocole :
Ce protocole peut être utilisé pour l’injection de pratiquement n’importe quel réactif soluble dans l’embryon syncytial de la drosophile : par exemple, soit une protéine fluorescente pour l’observation, soit un inhibiteur de protéine cible, soit les deux.
1. Collection d’embryons
- Mettez une nouvelle assiette de jus de raisin sur la cage de ponte.
- Retirez cette plaque au bout d’une heure, c’est la première collecte de la journée et souvent n’est pas très bonne. Il peut être jeté.
- Changez la plaque toutes les heures pour continuer à recueillir les embryons pendant une heure chacun.
2. Préparation de la lamelle
- Placez une lamelle de 50 x 22 mm sur un côté d’une lame de microscope. Collez les quatre coins à la glissière pour qu'elle ne bouge pas.
- À l’aide d’un applicateur à embout en coton, mettez une couche de colle heptane en une seule ligne sur la lamelle (la colle ne doit pas être visqueuse et doit sécher en quelques secondes, sinon ajoutez plus d’heptane).
- Mettez un morceau de ruban adhésif double sur la glissière vers le côté de la lamelle.
3. Préparation de l’embryon
REMARQUE : Les embryons doivent être imagés environ 2 heures après le début de la collecte, alors commencez les étapes suivantes en laissant suffisamment de temps pour les terminer dans ce laps de temps.
- À l’aide d’un pinceau humidifié, prélevez soigneusement les embryons de l’assiette de jus de raisin et placez-les sur du ruban adhésif double sur la lame.
- À l’aide de la partie externe de la pince à épiler, roulez les embryons sur le double ruban adhésif jusqu’à ce que le chorion (la membrane externe) s’ouvre.
- Prenez l’embryon en le faisant rouler doucement sur le chorion pour qu’il adhère à la pince à épiler et placez-le sur la colle heptane sur la lamelle avec le côté long de l’embryon parallèle au côté long de la lamelle. Disposez 10 à 20 embryons sur une rangée.
- Retirez la lamelle et placez-la dans la chambre de déshydratation pendant 3 à 8 minutes (cela dépend de l’humidité de la pièce et de la quantité à injecter).
- Placer sur une chambre métallique avec de la graisse sous vide.
- Recouvrez les embryons d’huile d’halocarbure 700 pour éviter une déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés.
4. Injection d’embryons
- Trouvez les embryons sous un objectif 16x.
- Éloignez les embryons et trouvez l’aiguille sans bouger le plan focal.
- Centrez l’aiguille et déplacez-la vers le haut sans la déplacer dans la direction x ou y.
- Si l’aiguille n’est pas ouverte, placez le bord de la lamelle dans le champ de vision, mais pas là où l’aiguille se trouvera, et abaissez l’aiguille au même plan focal. Déplacez très soigneusement la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche l’aiguille et l’ouvre doucement. Si l’aiguille est ouverte, passez à l’étape 5. (Les aiguilles peuvent être ouvertes avec de l’acide fluorhydrique avant le remplissage).
- Mettez les embryons en vue (mais pas là où l’aiguille sera), abaissez l’aiguille dans l’huile et assurez-vous d’obtenir de belles gouttes de liquide de l’aiguille.
- Déplacez soigneusement mais régulièrement l’embryon dans l’aiguille et injectez une goutte dans l’embryon et éloignez l’embryon. (Ou suivez les instructions de votre appareil d’injection).
- Une fois que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observés au microscope confocal.
