Dosage des points lumineux : une méthode pour étudier le comportement phototactique de la drosophile

Résumé

Source : Sun, Y., et al. Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis. J. Vis. Exp. (2019).

Les larves de drosophile sont sensibles à la lumière et réagissent aux changements de la lumière environnante. Cette vidéo décrit un test qui teste leur capacité à éviter la lumière, appelé test de taches lumineuses. Le protocole présenté montre comment configurer le test avec une LED de lumière bleue et montre comment enregistrer le comportement de l'animal en réponse à la rencontre avec la lumière.

Protocole

Ce texte de protocole est un extrait de Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Mise en place du système d’imagerie

1. Fixez une webcam haute résolution à l’aide d’une pince en fer, à environ 10 cm au-dessus du point lumineux sur le bureau (Figure 1).
2. Ajustez l’orientation de l’objectif de l’appareil photo vers le bureau. Connectez l’appareil photo à un ordinateur via une interface USB.
3. Placez une plaque de gélose sur le bureau, juste en dessous de l’appareil photo.
4. Ouvrez le logiciel « Amcap9.22 » sur l’ordinateur avec Windows 7, et le point lumineux s’affichera automatiquement dans la fenêtre d’AMcap. Déplacez légèrement la caméra vers la gauche ou la droite pour vous assurer que le point lumineux se trouve près du centre de la fenêtre. Assurez-vous que la caméra ne bloque pas le trajet de la lumière. Le point lumineux doit être complet et rond.
   REMARQUE : Le logiciel peut être trouvé à l’adresse http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixez un filtre passe-bande de 850 nm ± 3 nm avec un clip à 5-7 mm juste en dessous de la caméra.
   REMARQUE : Le diamètre du filtre est d’environ 2,5 cm et l’objectif de l’appareil photo a un diamètre inférieur à 1 cm, de sorte que le filtre peut couvrir le champ visuel de l’appareil photo. Avec le filtre sous la caméra, le point lumineux ne doit pas être vu dans la fenêtre d’AMcap.
6. Placez trois LED génératrices de lumière infrarouge (longueur d’onde centrale = 850 nm) uniformément autour de la plaque de gélose. Chaque LED doit être à environ 5 cm du bord de la plaque de gélose, et la face de la lentille de la LED doit être à un angle de 70° vers le bas vers la plaque de gélose. Connectez les LED à l’alimentation via le convertisseur AC-DC.
   REMARQUE : Il est préférable de fixer les positions et les angles des LED à lumière infrarouge pour assurer la cohérence de la luminosité du champ dans divers essais expérimentaux et faciliter le traitement vidéo ultérieur.
7. Placez un tableau noir entre l’ordinateur et l’appareil. Réglez la luminosité de l’écran de l’ordinateur pour éviter que la lumière de l’écran de l’ordinateur n’affecte l’expérience.
   REMARQUE : Gardez l’environnement sombre lors de la mesure de la longueur d’onde ou de l’intensité de la lumière.

2. Réglage des paramètres d’imagerie

1. Dans le menu du logiciel AMcap, choisissez Options | Appareil vidéo | Format de capture et réglez la taille des pixels de la vidéo capturée sur 800 x 600 et la fréquence d’images sur 60 ips.
2. Retirez le filtre sous l’appareil photo, placez une règle sous l’appareil photo et ajustez la mise au point de l’appareil photo pour que la ligne d’échelle soit claire et parallèle à la largeur du champ de vision vidéo.
3. Cliquez sur Capturer | Mise en place | Capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement, enregistrez la distance réelle correspondant à 600 pixels et calculez le rapport entre chaque pixel et la distance réelle.

3. Enregistrement vidéo du comportement d’évitement de la lumière

1. Maintenir une température de 25,5 °C pendant toutes les expériences. Contrôlez la température de la pièce à l’aide d’un climatiseur si nécessaire. Maintenez l’humidité constamment à 60 % avec un humidificateur.
2. Prenez une courte vidéo de la position du spot lumineux nommé « lightarea1 ». Ensuite, déplacez le filtre de 850 nm ± 3 nm vers l’arrière pour couvrir l’objectif de l’appareil photo.
   REMARQUE : Lors de l’enregistrement du comportement larvaire, l’objectif de la caméra est couvert par le filtre de 850 nm ± 3 nm afin que le point lumineux ne soit pas affiché dans la vidéo. Le point lumineux peut être reconstruit en vidéos avec des larves, plus tard avec Matlab. Ne modifiez pas la position de l’appareil photo et évitez de modifier le rapport entre chaque pixel et la distance réelle mesurée à l’étape 2.3.
3. Allumez une lumière (c’est-à-dire une lumière de pièce) loin de l’appareil expérimental. Baissez la lumière aussi bas que possible, tant que les larves sont clairement visibles avec les yeux. Sortez les larves du milieu de culture à l’aide d’une cuillère, cueillez délicatement une larve de troisième stade et lavez-la à l’eau distillée. Veillez à laver les larves une à la fois pour éviter l’interférence de la faim. Une seule expérience nécessite au moins 20 larves.
4. Transférez la larve au centre de la plaque de gélose placée sous la caméra lors de l’étape 1.3. Retirez délicatement l’excès d’eau de la larve à l’aide d’un pinceau ou utilisez du papier buvard pour éliminer l’eau de la larve afin d’éviter la réflexion de la lumière sous l’objectif. Éteignez la lumière de la pièce et laissez la larve s’acclimater pendant 2 minutes dans l’environnement sombre.
5. Allumez la lumière LED pour générer une lumière infrarouge et brossez doucement la larve au centre de la plaque. Lorsque la larve commence à ramper tout droit, tournez la plaque pour que la larve se dirige vers le point lumineux. Assurez-vous qu’il rampe dès le début, sinon il risque de ne pas avoir accès au point lumineux.
6. Cliquez sur Capturer | Mise en place | Capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement, puis cliquez sur Démarrer l’enregistrement pour enregistrer. Laissez la larve ramper vers le point lumineux, entrez dans le point lumineux, puis quittez le point lumineux jusqu’à ce qu’il soit presque hors du champ de vision. Cliquez sur Arrêter l’enregistrement. Si la larve se détourne du point lumineux avant de s’approcher, cliquez directement sur Arrêter l’enregistrement.
7. Éloignez le filtre de l’appareil photo. Prenez une courte vidéo de la position du spot lumineux nommé « lightarea2 » et comparez-la à « lightarea1 » pour vous assurer que la position du spot lumineux n’est pas modifiée. Si un changement de position évident est observé, éliminez les données.

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LED génératrice de lumière infrarouge de 850 nm ± 3 nm	Thorlabs, États-Unis	PM100A	Capteurs compatibles : Photodiode et Thermique Gamme de puissance optiquea : 100 pW à 200 W Gamme de longueurs d’onde du capteur disponible : 185 nm-25 μm Taux de rafraîchissement de l’écran : 20 Hz Bande passante : DC-100 kHz Plage du capteur de photodiodeb : 50 nA-5 mA Plage du capteur de thermopileb : 1 mV-1 V
Convertisseur AC vers DC	Thorlabs, États-Unis	S120VC	Taille de l’ouverture : Ø9,5 mm Gamme de longueurs d’onde : 200-1100 nm Plage de puissance : 50 nW-50 mW Type de détecteur : Photodiode Si (UV étendue) Linéarité : ±0,5 % Incertitude de mesure : ±3 % (440-980 nm), ±5 % (280-439 nm), ±7 % (200-279 nm, 981-1100 nm)
filtre passe-bande	Thorlabs, États-Unis	DC2100	Plage de courant LED : 0-2 A Résolution du courant LED : 1 mA Précision du courant LED : ±20 mA Tension directe des LED : 24 V Gamme de fréquences de modulation : 0-100 kHz Onde sinusoïdale Modulation : Arbitraire
Lumière bleue LED collimatée	ELP, Chine	USBFHD01M	Résolution max. : 1920x1080 F6.0 mm Capteur : CMOS 1/2,7" OV2710
Console compacte de wattmètre	Ocean Optics, États-Unis	USB2000+(RAD)	Dimensions : 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Poids : 190 g Détecteur : Sony ILX511B (réseau CCD linéaire en silicium de 2048 éléments) Gamme de longueurs d’onde : 200-850 nm Temps d’intégration : 1 ms – 65 secondes (20 secondes typiques) Plage dynamique : 8,5 x 10^7 (système) ; 1300:1 pour une seule acquisition Rapport signal/bruit : 250:1 (signal complet) Bruit d’obscurité : 50 RMS comptes Caillebotis : 2 (250 – 800 nm) Fente : SLIT-50 Lentille de collecte du détecteur : L2 Tri des commandes : OFLV-200-850 Résolution optique : ~2,0 nm FWHM Lumière parasite : <0,05 % à 600 nm ; <0,10 % à 435 nm Connecteur à fibre optique : SMA 905 à 0,22 ouverture numérique fibre monobrin
Pilote LED haute puissance	Minhongshi, Chine	MHS-48XY	Tension de fonctionnement : DC12V Longueur d’onde centrale : 850 nm
Caméra Web haute résolution	Thorlabs, États-Unis	MWWHL4	Couleur : Blanc chaud Température de couleur corrélée : 3000 K Courant de test pour une puissance LED typique : 1000 mA Courant maximum (CW) : 1000 mA Bande passante (FWHM) : N/A Puissance électrique : 3000 mW Angle de vision (plein angle) : 120° Taille de l’émetteur : 1 mm x 1 mm Durée de vie typique : >50 000 h Température de fonctionnement (sans condensation) : 0 à 40 °C Température de stockage : -40 à 70 °C Groupe de risquea : GR1 – Groupe de risque faible
LED Blanc chaud	Mega-9, Chine	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bande passante : 22±3nm Transmittance de crête : 80 % Longueur d’onde centrale : 850 nm±3 nm
spectromètre	Noël Danjou	Amcap9.22	AMCap est une application de capture de photos et de vidéos avec des fonctionnalités avancées de prévisualisation et d’enregistrement. Il s’agit d’une application de bureau conçue pour les ordinateurs exécutant Windows 7 SP1 ou une version ultérieure. La plupart des appareils compatibles avec la vidéo pour Windows et DirectShow sont pris en charge, qu’il s’agisse de webcams bon marché ou de cartes de capture vidéo avancées.
Capteur de puissance à photodiode standard	Super Dragon, Chine	YGY-122000	Entrée : AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0.8A Sortie : DC 12V 2A
Capteur de puissance thermique	Thorlabs, États-Unis	M470L3-C1	Couleur : Bleu Longueur d’onde nominalea : 470 nm Bande passante (FWHM) : 25 nm Courant maximum (CW) : 1000 mA Tension directe : 3,2 V Puissance électrique (max.) : 3200 mW Taille de l’émetteur : 1 mm x 1 mm Durée de vie typique : 100 000 h Température de fonctionnement (sans condensation) : 0 à 40 °C Température de stockage : -40 à 70 °C Groupe de risqueb : GR2 – Groupe de risque modéré
Capteur de puissance thermique	Thorlabs, États-Unis	S401C	Gamme de longueurs d’onde : 190 nm-20 μm Gamme de puissance optique :10 μW-1 W(3 Wb) Taille de l’ouverture d’entrée : Ø10 mm Zone du détecteur actif : 10 mm x 10 mm Densité de puissance optique maximale : 500 W/cm2 (moy.) Linéarité : ±0,5 %