Dissection de la glande annulaire larvaire : isolement des organes endocriniens du développement de la drosophile

Résumé

Source : Imura, E., et al. Protocoles pour la visualisation des organes stéroïdogènes et de leurs organes interactifs avec immunocoloration chez la mouche des fruits Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit la glande annulaire de la drosophile, une structure endocrinienne complexe importante pour la biosynthèse et la sécrétion d’ecdystéroïdes et d’autres hormones. Le protocole présenté démontre sa dissection, sa fixation et son immunomarquage.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Imura et al., Protocoles pour la visualisation des organes stéroïdogènes et de leurs organes interactifs avec immunomarquage chez la mouche des fruits Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

REMARQUE : Le schéma général des protocoles est illustré dans Figure 1.

1. La dissection de la glande annulaire larvaire (RG)

NOTE : Chez D. melanogaster, qui appartient aux diptères cyclorrhaphes, le PG se trouve dans un organe endocrinien composite appelé glande annulaire (RG, Figure 2D). Comme il est impossible de séparer chirurgicalement le PG d’autres types de cellules (discuté plus loin), un objectif pratique est d’isoler un RG intact et non endommagé par dissection.

1. Préparation des larves aux stades de développement appropriés
   REMARQUE : Pour synchroniser les stades de développement des larves de D. melanogaster, il est nécessaire de collecter les œufs dans une fenêtre de temps étroite et de collecter les larves au moment opportun.
   1. Recueillir les œufs pendant 2 h sur une plaque de gélose au jus de raisin à 25 °C.
   2. Prélevez les larves du 1er stade nouvellement écloses à l’aide d’un microscope de dissection à l’aide d’une pince et transférez-les dans un petit flacon contenant de la levure standard et de la semoule de maïs.
      REMARQUE : L’âge des larves est représenté par « heures après la ponte (hAEL) », « heures après l’éclosion (hAH) » ou « heures après l’excdysse L3 (hAL3E) ».
   3. Au moment approprié, prélevez les larves stabilisées à l’aide d’une boucle en plastique jetable pour éviter des blessures indésirables. Pour minimiser une différence dans la progression du développement des larves du 3e stade, prélevez les larves du 2e stade à 70 hAEL (48 hAH) et laissez-les muer à intervalles de 2 h. Ensuite, récoltez les larves du 3^ème stade dans les 2 h suivant l’ecdysis L3 ; cette procédure donne 0-2 larves hAL3E.
   4. Transférez les larves stabilisées dans un plat rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   5. Rincez les larves avec du PBS pour éliminer les restes de nourriture du corps.
2. Dissection grossière de larves au microscope de dissection
   1. Tenez le crochet buccal d’une larve avec une pince. Sectionnez le corps larvaire au tiers antérieur de la longueur du corps à l’aide de micro-ciseaux.
   2. Tenez l’extrémité coupée du corps larvaire antérieur avec une paire de pinces. À l’aide de l’autre paire de pinces, poussez doucement le bout de la tête vers l’intérieur du corps ; Cette procédure retourne le corps larvaire.
      REMARQUE : Cette étape peut être sautée pour la dissection des larves du^1er stade.
   3. Répétez les étapes 1.2.1-1.2.2 avec d’autres larves pendant 5-10 min
      REMARQUE : Le nombre de larves doit être égal ou inférieur à 20 pour gagner du temps pour la dissection.
3. Fixation et coloration des tissus par immunohistochimie
   1. Placez le tiers antérieur des corps larvaires (étape 1.2.2) dans un microtube de 1,5 mL rempli de 500 μL de solution fixe (4 % de paraformaldéhyde dans du PBS). Fixez moins de 20 échantillons à la fois, sinon le PBS attaché aux échantillons fixés peut provoquer une dilution défavorable du fixateur. Pour la dissection de congé, prélevez une goutte de PBS, puis ajoutez une goutte de solution fixe.
      REMARQUE : Pour une solution fixe, on peut utiliser soit du formaldéhyde à 3,7 %, soit du paraformaldéhyde à 4 %.
   2. Incuber les tissus disséqués dans la solution fixe pendant 30 min à température ambiante (RT) ou pendant 2 h à 4 °C.
   3. Remplacez la solution fixe par 500 μL de PBS et rincez rapidement les échantillons 3 fois. Laver les échantillons avec 500 μL de PBT à 0,3 % (PBS + 0,3 % d’éthoxylate d’octylphénol) pendant 15 min sur une bascule à RT. Pour la dissection de filets, retirer les broches à insectes et transférer les échantillons dans un microtube de 1,5 mL.
      REMARQUE : Pour augmenter la perméabilité des anticorps dans les tissus, les échantillons sont traités avec 500 μL 2,0 % PBT pendant 1 à 2 h sur un rocker à RT.
   4. Remplacer le PBT par une solution bloquante de 500 μL (2 % d’albumine sérique bovine dans le PBT). Incuber les échantillons pendant 1,5 h sur une bascule à RT.
   5. Remplacer la solution bloquante par 50 μL de solution d’anticorps primaires, c’est-à-dire des anticorps dilués dans la solution bloquante.
   6. Incuber les échantillons pendant la nuit sur une bascule à 4 °C.
   7. Remplacez la solution d’anticorps primaires par 500 μL de PBT à 0,3 % et rincez rapidement les échantillons 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 μL de PBT à 0,3 % pendant 15 minutes chacune sur une bascule à RT.
   8. Remplacer le PBT à 0,3 % par 50 μL de solution d’anticorps secondaires (anticorps conjugués à un colorant dilués dans la solution bloquante). Pour la coloration nucléaire, 0,5 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, solution mère de 0,1 mg/mL) est ajouté à une solution de 50 μL. Incuber les échantillons sur une bascule pendant 2 h à RT ou à 4 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Gardez les échantillons dans l’obscurité.
   9. Remplacer la solution d’anticorps par 500 μL de PBT à 0,3 % et rincer 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 μL de PBT à 0,3 % pendant 15 minutes chacune à RT.
4. Dissection fine du complexe cerveau-RG contenant le PG et le montage
   1. À l’aide d’une pipette jetable, transférez les échantillons immunocolorés dans une boîte remplie de PBT à 0,3 %.
      REMARQUE : Pour éviter les bulles gênantes lors de la dissection et du montage, le PBT à 0,3 % peut être remplacé par du PBS.
   2. Sous un microscope à dissection, tenez la cuticule ou le crochet buccal avec une paire de pinces. À l’aide d’une aiguille de 27 g attachée à une seringue de 1 mL comme « couteau », coupez l’extrémité antérieure de l’œsophage et les disques oculaires pour retirer le complexe cerveau-RG-disque oculaire de la cuticule du corps.
   3. Séparez l’œsophage et l’intestin du complexe cerveau-RG-disque oculaire à l’aide d’une pince. Étant donné que l’œsophage passe à travers le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral (VNC), tirez l’intestin vers la face postérieure.
      REMARQUE : Pour retirer des disques imaginaux supplémentaires des échantillons, coupez les connexions entre le cerveau, les disques oculaires et les disques des jambes avec un couteau à aiguille.
   4. Répétez les étapes 1.4.1-1.4.4 pour les autres samples.
      REMARQUE : Pour éviter que les débris de tissus ne collent aux échantillons, transférez chaque échantillon terminé dans une boîte propre différente remplie de PBT ou de PBS à 0,3 %.
   5. Transférez les échantillons au centre d’une lame de verre propre à l’aide d’une micropipette.
      REMARQUE : Pour les larves du 2e ou 3e stade, l’extrémité de la pointe d’une micropipette doit être tronquée avec une lame de rasoir.
   6. À l’aide d’un microscope à dissection, alignez les échantillons individuels avec leur face dorsale vers le haut à l’aide d’une pince
      REMARQUE : Le RG est situé sur la face dorsale du cerveau (Figure 2A). Cet alignement facilite la spécification d’échantillons individuels pendant l’imagerie.
   7. Inclinez une lame de verre et essuyez autant d’excès de PBT que possible. Mettez une goutte de réactif de montage sur un côté de la lame. Placez le bord d’une lamelle de l’autre côté de la goutte et placez lentement la lamelle sur les échantillons à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : Cette procédure empêche les échantillons de se déplacer à l’extérieur de la lamelle.
   8. Conservez les échantillons à 4 °C. Conservez les échantillons dans l’obscurité.

Résultats

Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collecte des œufs
Boîte de culture tissulaire (55 mm)	COMME UN	Tél. : 1-8549-02	pour plaques d’agar au jus de raisin
gobelet de collecte	HIKARI KAGAKU
pâte de levure	Levure sèche orientale, Tokyo
100 % jus de raisin	Welch Food Inc.
Élevage des larves
petits flacons (12 ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	Référence 58.487
boucle jetable	COMME UN	Référence : 6-488-01
Nourriture anti-mouches standard			La recette est sur le site Web du centre de stockage de Bloomington.
dissection
microscope de dissection	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
microscope de dissection	Leica	S8 AP0
Boîte de culture tissulaire (35 x 10 mm, non traitée)	IWAKI	Référence 1000-035
Sylgard	TORAY		silicone coarting à l’intérieur des plats
Aiguille Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Un « couteau » pour couper le tissu
pince, Inox, #5	Dumont, Suisse
Épingle à insectes (0,18 mm de diamètre)	Marque Shiga		pour la dissection d’angle
Micro ciseaux	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fixation
Eau ultrapure	Merck Millipore
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Formaldéhyde	Nacalai tesque	Référence 16222-65
paraformaldéhyde	Nacalai tesque	Référence 02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	Référence 35501-15
Microtubes (1,5 ml)	INA OPTIKA	Référence CF-0150
Incubation
Comme un mélangeur à swist TM-300 (à bascule)	Comme un seul	Le TM-300	rockeur
Albumine sérique bovine	sigma	Référence 9048-46-8
Anticorps primaire
anti-Sro (cobaye), 1:1000
anti-GFP (lapin), 1:1000	Sondes moléculaires	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mAb de souris, GF200), 1:100	Nakarai tesque	Référence 04363-66
anti-5HT (lapin), 1:500	sigma	S5545
anti-Hts 1B1 (souris)	Banque d’hybridomes d’études développementales (DSHB)	1B1
anti-DE-cadhérine (rat), 1:20	DSHB	DACM2
Anti-NC82 (souris), 1:50	DSHB	NC82
Anticorps secondaires
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488	Technologies de la vie	A-11008
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488	Technologies de la vie	A-11001
Anticorps secondaire anti-Rat IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 546	Technologies de la vie	A-11081
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 555	Technologies de la vie	A-21435
Alexa Fluor 546 phalloïdine conjuguée à un colorant	Technologies de la vie	A-22283
Réactifs d’enrobage
Micro diapositive en verre	Matsunami Glass Ind., Ltd.	SS7213
Verre de protection de microscope carré	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C218181
Réactif FluorSave (réactif de montage)	Calbiochimie	345789
Pipette de transfert 1 ml (compte-gouttes jetable)	Watson	Référence 5660-222-1S
Stocks de mouches
w ; GMR45C06-GAL4			du Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS-GFP ; UAS–mCD8 ::GFP			dons de K. Ito, Université de Tokyo.
w[1118]
w ; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w ; UAS-mCD8 ::GFP ; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) et Alekseyenko, O. V, Lee, C. et Kravitz, E. A. (2010)
w ; UAS-mCD8 ::GFP			du Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw ;; nSyb-GAL4			du Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)