Ce protocole est un extrait de Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Dosage local de la sonde thermique
Nous délivrons un stimulus thermique nocif à un segment individuel du corps larvaire à l’aide d’une sonde thermique fabriquée sur mesure par Pro-Dev Engineering (voir Tableau des matériaux). Bien que cette sonde présente des caractéristiques de conception optimales (une petite pointe métallique de ~ 0,07 mm, une zone 2 et la capacité de maintenir avec précision une température de consigne de 23 °C à 65 °C), en principe, tout outil avec une petite pointe pouvant être chauffé à une température définie pendant une période allant jusqu’à 20 secondes devrait suffire. L’extrémité de la sonde est utilisée pour stimuler les larves précoces du 3e stade précisément sur la ligne médiane dorsale au niveau du segment abdominal A4 (voir Figure 1). En réponse à ce stimulus thermique, les larves présentent généralement un comportement de retrait aversif de roulement latéral de 360 degrés ou plus. Ce comportement est distinct de leur réponse légère à une sonde métallique non nocive à température ambiante, ce qui implique généralement une brève pause dans leur activité locomotrice.
Protocole pour le dosage de la sonde thermique :
- Température préréglée de la sonde thermique jusqu’au point de consigne souhaité.
- À l’aide d’un pinceau ou d’une pince, vous pouvez transférer délicatement une larve individuelle sur une plate-forme plate (nous utilisons généralement un petit morceau de vinyle découpé dans un liant) sur laquelle les larves seront ensuite stimulées. La larve doit être recouverte d’une fine pellicule d’eau avant d’entrer en contact avec la sonde thermique. Le film d’eau recouvrant la larve doit être le plus petit possible et couvrir complètement la larve, tout en veillant à ce que la larve ne soit pas sèche lorsqu’elle touche le vinyle.
- Appuyez doucement la pointe de la sonde contre la larve au niveau du segment A4 en exerçant une légère pression avec la pointe à un angle d’environ 45° entre la sonde et la surface de la larve (voir Figure 1). La pression doit provoquer une légère indentation à la surface de la larve et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion. Si la larve continue de bouger, appliquez un peu plus de pression et elle s’arrêtera généralement. Ne pas consigner de données provenant de larves qui se déplacent au-delà du champ de vision ou pour lesquelles il est impossible d’établir un contact constant avec la sonde jusqu’à ce qu’il réponde ou qu’il atteigne la limite de 20 secondes.
- Continuez à stimuler la larve jusqu’à ce qu’une réponse de retrait se manifeste ou jusqu’à ce que la limite de 20 secondes soit atteinte, selon la première éventualité. Les larves qui répondent montrent généralement d’abord un comportement préliminaire consistant à lever la tête et la queue. Ceci est généralement suivi par le comportement de retrait de rouler d’au moins 360 degrés. Seul un roulis complet de 360 degrés est considéré comme un comportement nocifensif (le soulèvement préliminaire de la tête ou de la queue ne l’est pas).
- Une fois que le comportement de retrait est initié, relâchez le contact avec la sonde et enregistrez la latence ou le temps de retrait. Si aucun comportement de retrait n’est observé dans les 20 secondes, la larve ne répond pas. Les intervenants peuvent être divisés en 2 catégories. Si le comportement de retrait se manifeste dans les 5 secondes, la larve répond rapidement. Si le comportement de retrait est montré entre 5 et 20 secondes, alors la larve répond lentement (voir Figure 1 dans Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
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