Ce protocole est un extrait de Liu et al. Un essai de gradient de température pour déterminer les préférences thermiques des larves de drosophile, J. Vis. Exp. (2018).
1. Configuration du gradient de température
- Préparation d’une pente unidirectionnelle
- Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placez les deux blocs d’aluminium reliés à deux bains-marie sur du papier absorbant humide, séparés de 10 cm (Figure 1A).
- Allumez les deux bains-marie ~2 h avant de commencer le test pour laisser suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibre.
REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer une expérience fictive pour déterminer la température de chaque bain-marie nécessaire pour obtenir le gradient de température linéaire souhaité. Certaines paires de températures typiques pour régler les bains-marie sont énumérées dans le tableau 1. Cependant, notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur des tubes affecte également les températures car il y a un refroidissement dans les tubes. La longueur du tube dans notre installation est de 1,5 m.
- Passez au micro-ondes 100 ml d’agarose à 1 % à haute puissance dans une bouteille ronde à large goulot de 500 ml et versez 25 ml/plaque de dosage sur une paillasse plane. Préparez deux plaques de dosage, qui peuvent être placées sur les blocs d’aluminium en même temps (Figure 1A).
- Une fois que l’agarose s’est solidifiée (10-20 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une éponge à mélamine pour rendre la surface de l’agarose légèrement grossière, de sorte que lors de la pulvérisation d’eau sur le gel d’agarose, une fine membrane d’eau lisse sera créée et qu’aucune gouttelette d’eau ne se formera.
- Immergez complètement les plaques dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu’à ce que le test soit prêt à être effectué pour éviter que les plaques ne se dessèchent.
- Préparez une pente bidirectionnelle (facultatif)
- Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placez trois blocs d’aluminium à 8 cm de distance (Figure 1B) sur des serviettes en papier humides.
- Allumez les deux bains-marie ~2 h avant de commencer le test pour laisser suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibre.
REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer une expérience fictive pour déterminer la température de chaque bain-marie pour le gradient bidirectionnel. Certaines paires de températures typiques pour régler les bains-marie sont énumérées dans le tableau 2. Cependant, notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur des tubes affecte également les températures car il y a un refroidissement dans les tubes. La longueur du tube dans notre installation est de 1,5 m.
- Pour éviter que l’agarose ne se déverse de la plaque, enveloppez les bords de la plaque d’aluminium avec du ruban adhésif d’étiquetage pour former une paroi de 10 mm de haut (Figure 1B).
- À l’aide du réglage haute puissance, passez au micro-ondes 200 ml d’agarose à 1 % dans une bouteille ronde à large goulot de 500 ml et versez 120 ml sur une plaque de dosage.
- Une fois que l’agarose s’est solidifiée (~30 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une éponge à mélamine pour rendre la surface de l’agarose légèrement grossière, de sorte que lors de la pulvérisation d’eau sur le gel d’agarose, une fine membrane d’eau lisse soit créée et qu’aucune gouttelette d’eau ne se forme.
- Immergez complètement les plaques de test dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu’à ce que le test soit prêt à être effectué pour éviter qu’elles ne se dessèchent.
- Configurer une pente unidirectionnelle
- Préparez les réactifs et les éléments sur une paillasse à côté de l’appareil de dosage par gradient (voir le tableau des matériaux).
- Pour favoriser un transfert de température efficace, remplissez les espaces entre les blocs d’aluminium et les plaques de dosage en pulvérisant de l’eau à l’interface entre les blocs et la plaque.
- À l’aide de gants, retirez les plaques de dosage du récipient d’eau. Si de l’eau s’infiltre entre le gel d’agarose et la plaque et provoque la formation de bosses à la surface, prélevez l’eau à l’aide d’une micropipette P1000.
- Placez les plaques de dosage sur les blocs d’aluminium de manière à ce que les démarcations qui se trouvent à 2 cm de chaque bord correspondent exactement aux bords des blocs d’aluminium (Figure 1A,C).
- Vaporisez de l’eau sur la surface de la plaque (une fine membrane d’eau recouvrant la surface de l’agarose suffit) pour éviter que le gel d’agarose ne se dessèche. Assurez-vous que la membrane d’eau est continue et exempte de gouttelettes d’eau, car les larves peuvent être piégées dans les gouttelettes d’eau.
- Couvrez le système de dégradé avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et aider à stabiliser la température de la surface du gel. Attendez 5 à 10 minutes pour permettre à la température de s’équilibrer.
- Vérifiez la température de surface en 12 points sur la plaque (Figure 1C). Prenez deux mesures à l’intérieur de chaque zone pour déterminer s’il y a ou non variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température aux deux endroits est à ± 0,2 °C de la température souhaitée.
REMARQUE : La variabilité à l’intérieur d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux points par rapport au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour vous assurer que les démarcations qui se trouvent à 2 cm de chaque bord correspondent exactement aux bords des blocs d’aluminium.
- Si le gradient de température mesuré s’écarte du gradient souhaité, augmentez ou diminuez le(s) réglage(s) de température du bain-marie et vérifiez à nouveau la température de surface une fois que la température du ou des bains-marie s’est stabilisée(s).
- Couvrez le système de gradient avec une boîte en carton jusqu’au début du test.
- Configurer une pente bidirectionnelle (facultatif)
- Préparez les réactifs et les éléments sur une paillasse à côté de l’appareil de dosage par gradient (voir le tableau des matériaux).
- Vaporisez de l’eau sur les surfaces des trois blocs d’aluminium pour favoriser un transfert efficace de la température des blocs d’aluminium aux plaques d’essai en comblant les espaces entre les surfaces.
- Retirez délicatement les plaques de dosage du récipient d’eau et placez-les sur les blocs d’aluminium. Si de l’eau envahit entre le gel d’agarose et la plaque, ce qui pourrait provoquer la formation de bosses à la surface, prélevez l’eau à l’aide d’une micropipette P1000.
- Placez la plaque de test sur les blocs d’aluminium de manière à ce que les lignes médianes de la première et de la dernière zone de chaque bord correspondent exactement aux bords des deux blocs d’aluminium latéraux (Figure 1B,D).
- Vaporisez de l’eau sur la surface de la plaque (une fine membrane d’eau recouvrant la surface de l’agarose suffit) pour éviter que le gel d’agarose ne se dessèche. Assurez-vous que la membrane d’eau est continue et exempte de gouttelettes d’eau, car les larves peuvent être piégées dans les gouttelettes d’eau.
- Couvrez le système de dégradé avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et aider à stabiliser la température de la surface du gel. Attendez 5 à 10 minutes pour permettre à la température de s’équilibrer.
- Vérifiez la température de surface en deux points le long de la ligne médiane de chacune des 10 zones (Figure 1D). Prenez deux mesures à l’intérieur de chaque zone pour déterminer s’il y a ou non variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température aux deux endroits est à ± 0,2 °C de la température souhaitée.
REMARQUE : La variabilité à l’intérieur d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux points par rapport au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour vous assurer que les lignes médianes de la première et de la dernière zone les plus proches de chaque bord correspondent exactement aux bords des deux blocs d’aluminium latéraux.
- Si le gradient de température mesuré s’écarte du gradient souhaité, ajustez le(s) réglage(s) de température du bain-marie et vérifiez à nouveau la température de surface une fois que la température du ou des bains-marie s’est stabilisée(s).
- Couvrez les blocs avec une boîte en carton jusqu’au début du test.
2. Dosage et calcul
- Retirez la boîte en carton et vérifiez la température de surface du gel immédiatement avant de transférer les larves sur la plaque. Minimisez le temps d’ouverture de la boîte en carton pour éviter de perturber l’équilibre de la température. Si la surface est sèche, vaporisez une petite quantité d’eau sur la surface.
- Répartir 150 ± 50 larves près du centre de chaque plaque (entre les zones 3 et 4 des 6 zones) pour le gradient unidirectionnel (zone de lâcher ; Figure 1C).
REMARQUE : Pour le gradient bidirectionnel, répartissez 200 à 400 larves le long de la zone médiane de chaque moitié (Figure 1D).
- Placez un couvercle de microplaque sur chaque plaque d’essai pour empêcher les larves de ramper hors de la carte. Couvrez l’installation avec une boîte en carton pour éviter l’exposition à la lumière, ce qui pourrait affecter le choix des larves sur le gel d’agarose.
REMARQUE : Pour le gradient bidirectionnel, il ne devrait pas être nécessaire de couvrir la plaque avec un couvercle, car la plaque est plus grande et la température préférée des larves se situe dans la zone médiane. Par conséquent, peu de larves s’accumulent sur les bords et ont la possibilité de ramper hors de l’eau.
- Laisser l’essai se poursuivre pendant 10 à 30 minutes pour le gradient unidirectionnel, et pendant 15 à 35 minutes pour le gradient bidirectionnel, selon l’âge des larves (tableau 3).
- Retirez la boîte en carton et le couvercle de la microplaque. Photographiez les plaques d’en haut à l’aide d’un appareil photo numérique. Prenez deux photos de chaque plaque d’analyse afin que l’enquêteur puisse choisir celle qui offre le meilleur contraste et la meilleure luminosité pour l’analyse.
- Retirer toutes les larves des plaques d’essai et de tout endroit à l’extérieur des plaques par aspiration.
- Nettoyez soigneusement les plaques de test, les tubes et la crépine de la cellule avec de l’eau distillée. Réutilisez les plaques de dosage préparées ce jour-là, à moins que la surface de l’agarose ne soit endommagée.
- Calculez la répartition en pourcentage des larves dans chaque zone.
- Ouvrez l’image photographique des résultats de l’analyse à l’aide de n’importe quel logiciel permettant d’ajouter des marques à l’image. Pour indiquer les zones d’essai, tracer des lignes verticales tous les 2 cm en fonction des démarcations sur la plaque d’essai.
- Comptez le nombre de larves dans chaque zone et notez les nombres. Ne comptez pas les larves dans les régions situées à 0,5 cm des parois. Le gel est plus épais près des parois et les températures de surface ne sont pas linéaires dans ces régions.
- Pour le gradient unidirectionnel, calculez la distribution en pourcentage dans chaque zone comme suit :
(nombre de larves dans une zone donnée de 2 cm)/ (nombre total de larves dans 6 zones) x 100.
- Pour le gradient bidirectionnel, calculez la distribution en pourcentage dans chaque zone comme suit :
(nombre de larves dans une zone donnée de 2 cm)/ (nombre total de larves dans 5 zones de chaque côté du gradient) x 100.
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