Ce protocole est un extrait de Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Chargement des mouches dans les tubes d’activité et le système de surveillance de l’activité locomotrice
- Avant de charger les mouches dans les tubes d’activité, allumez les incubateurs qui seront utilisés pour abriter les moniteurs d’activité. Ajustez la température à l’aide des commandes de l’incubateur et réglez le régime lumière/obscurité à l’aide du contrôleur de lumière du système DAM OU du système de contrôle de la lumière de l’incubateur selon le plan d’expérience souhaité. Le temps nécessaire pour charger les mouches dans les tubes d’activité doit être suffisant pour que la température se stabilise.
- Anesthésie les mouches avec du dioxyde de carbone.
- À l’aide d’un pinceau fin, vous pouvez transférer délicatement une mouche dans un tube d’activité.
- Saisissez le milieu d’un seul morceau de fil d’environ un demi-pouce avec une pince fine et insérez le fil dans l’extrémité non alimentaire du tube d’activité pour boucher l’ouverture et empêcher la mouche de s’échapper pendant l’expérience, tout en permettant à l’air de circuler dans le tube. Alternativement, des capuchons en plastique avec de petits trous (Trikinetics, Inc.) peuvent être utilisés pour fermer l’ouverture.
- Assurez-vous que les tubes sont posés sur le côté jusqu’à ce que la mouche se réveille, sinon il y a un risque que la mouche se colle à la nourriture.
- Insérez les tubes dans les moniteurs d’activité. Avec le modèle plus récent et plus compact des moniteurs Trikinetics (Trikinetics DAM2 et DAM2-7), il est nécessaire de maintenir les tubes en place avec des élastiques pour s’assurer que le faisceau infrarouge passe le tube en position centrale.
- Placez les moniteurs d’activité dans les incubateurs et connectez-les au système de collecte de données via les fils téléphoniques. Vérifiez à l’aide du logiciel de collecte du système DAM que tous les moniteurs sont correctement connectés et que les données sont collectées à partir de chacun d’entre eux. Le moniteur émet un faisceau de lumière infrarouge au centre de chaque tube d’activité en verre. L'activité locomotrice des mouches est enregistrée sous forme de données binaires brutes où « un » est enregistré chaque fois que le faisceau infrarouge est interrompu ou un « zéro » est enregistré dans lequel le faisceau infrarouge n'est pas interrompu.
2. Conception expérimentale pour l’enregistrement des données pour la détermination de la périodicité et de l’amplitude circadiennes
- Les mouches sont synchronisées et entraînées en les exposant à la lumière/obscurité (LD) et au régime de température souhaités pendant 2 à 5 jours complets. La condition d’entraînement la plus couramment utilisée est un cycle lumière/obscurité de 12 heures de lumière / 12 heures d’obscurité (12:12 LD) à 25 °C. Cette condition standard généralement acceptée est essentiellement basée sur l’idée que la drosophile est originaire de lieux afro-équatoriaux. Lorsque l’on étudie les rythmes circadiens, il y a une phraséologie avec laquelle il faut se familiariser. En ce qui concerne ce protocole, le moment où les lumières s’allument dans l’incubateur est défini comme le temps zeitgeber 0 (ZT0) et tous les autres temps sont relatifs à cette valeur (par exemple, dans un cycle LD 12:12, ZT12 est le moment où les lumières sont éteintes). Dans des conditions standard de LD de 12:12, Drosophila melanogaster de type sauvage présente généralement deux épisodes d’activité ; l’un centré autour de ZT0 appelé pic « matinal » et l’autre autour de ZT12 appelé pic « soir » (Figure 1A). Les épisodes du matin et du soir sont contrôlés par l’horloge endogène, mais il existe également des réponses de « sursaut » qui sont des poussées transitoires d’activité en réponse aux transitions lumière/obscurité. Deux jours d’entraînement sont le minimum et pourraient être utilisés, par exemple, sur de grands écrans qui prennent plus de temps et sont orientés vers la mesure de périodes de fonctionnement libre dans l’obscurité constante (voir ci-dessous, étape 2). Cependant, si vous souhaitez étudier les modèles d’activité au cours d’un cycle quotidien lumière-obscurité, il est préférable de maintenir les mouches pendant 4 à 5 jours en LD afin d’obtenir plus de données. Essentiellement, l’augmentation du nombre de mouches ou du nombre de jours de TA dans l’analyse finale des données (p. ex., les données de pool des deux derniers jours d’activité locomotrice de TA) générera des profils et des mesures d’activité diurne plus fiables (p. ex., le moment du pic du matin ou du soir). De plus, la répartition quotidienne de l’activité varie en fonction de la durée du jour (photopériode) et de la température. L’une des principales raisons de modifier la photopériode ou la température par rapport à la norme est que l’on voulait étudier comment les modèles d’activité quotidienne subissent une adaptation saisonnière (par exemple, Chen et al., Cold Spring, Harb, Symp, Quant, Biol. (2007)). La drosophile peut également être entraînée à des cycles de température quotidiens (par exemple Glaser et Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Des cycles de température qui ne varient que de 2 à 3 °C sont suffisants pour entraîner les rythmes d’activité.
- Les rythmes d’activité locomotrice en course libre sont mesurés dans des conditions d’obscurité et de température constantes après la fin de la période d’entraînement (voir ci-dessus, étape 1). Le réglage du cycle de lumière peut être modifié à tout moment dans la phase d’obscurité le dernier jour de la LD, de sorte que le jour suivant de l’expérience représente le premier jour de la DD. Sept jours de collecte de données de la DD sont suffisants pour calculer la période circadienne et l’amplitude (par exemple, la puissance ou la force du rythme) des mouches. En général, une taille d’échantillon d’au moins 16 mouches est nécessaire pour obtenir des périodes de course libre fiables pour un génotype particulier. Même si l'on ne s'intéresse qu'à la mesure de l'activité diurne, il est toujours préférable de mesurer les périodes de course libre des mouches en DD, car les changements de période endogène peuvent modifier la distribution quotidienne de l'activité en LD. Par exemple, les mouches ayant de longues périodes endogènes présentent généralement des pics nocturnes retardés de LD (par exemple, voir Figure 2).
- À la fin de l’expérience, les données binaires brutes collectées à l’aide du logiciel du système DAM sont téléchargées sur un périphérique de stockage de données portable, par exemple une clé USB.
- Les données binaires brutes sont traitées à l’aide de DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) et additionnées en groupes de 15 et 30 minutes lors de l’analyse des paramètres circadiens, ou en groupes de 1 à 5 minutes lors de l’analyse des paramètres de sommeil/repos. À l’heure actuelle, cinq minutes d’inactivité consécutives constituent la définition standard du sommeil et du repos chez la drosophile (Hendricks et al., Neuron (2000) ; Ho et Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
- Il existe de nombreuses façons différentes d’analyser les données collectées sur le système DAM, mais nous ne fournirons que les méthodes couramment utilisées dans notre laboratoire. Microsoft Excel est utilisé pour attribuer le génotype à différents groupes d’échantillons. logiciels FaasX (M. Boudinot et F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, France) ou Insomniac (programme basé sur Matlab ; Leslie Ashmore, Université de Pittsburgh, Pennsylvanie) sont utilisés pour examiner respectivement les paramètres circadiens (par exemple, les règles et la puissance) ou le sommeil/repos (par exemple, le pourcentage de sommeil, la durée moyenne du repos).
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