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Ce protocole est un extrait de de de Vries et Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Générer des mouches Channelrhodopsin
- Cross UAS-ChR2 vole avec le pilote Gal4 de votre choix, nous utilisons G105-Gal4, qui est exprimé dans les neurones Foma-1 dans le lobe optique.
- Pour éliminer la possibilité d’une réponse visuelle à la stimulation par la lumière bleue, les deux lignes de mouche sont dans un fond w+norpA.
- Résultat final : w+norpA ; G105-GA4/UAS-ChR2 +
- Une fois que les mouches adultes se sont approchées, donnez aux femelles sélectionnées de la nourriture fraîche, supplémentée en 10 μM all-trans-retinal (un cofacteur requis pour ChR2) et à l’abri de la lumière, pendant 3 jours avant d’effectuer le test comportemental.
2. Préparer des aliments améliorés tout-trans-rétiniens de 10 μM
- Dissoudre 100 mg de rétinal trans dans 17,6 ml d’éthanol à 95 % pour obtenir 20 mM de rétinal. Gardez tout-trans-rétinien à l’abri de la lumière à tout moment.
- Faites fondre la semoule de maïs standard au micro-ondes et laissez refroidir jusqu’à ce qu’elle soit chaude au toucher.
- Mélangez 50 μl de 20 mM de tout trans-rétinien dans des flacons de 10 ml de nourriture pour mouches.
- Laissez refroidir les flacons et conservez-les à l’abri de la lumière.
3. Équipement
- Pointes de pipette : Les pointes de pipette standard de 1 000 μl sont coupées près de la pointe, créant un diamètre de pores de ~2,25 mm.
- Plateforme (voir Figure 1).
- Une base en Delrin, de 17 cm X 25 cm, a été construite avec des trous filetés à chaque coin pour s’adapter aux raccords de tuyau de refroidissement 1/4" NPT.
- Un support vertical, en Delrin, est fixé au centre de la base. Les dimensions totales sont de 25 mm X 40 mm X 65 mm (largeur X profondeur X hauteur). Une rainure de 10 mm de large s’étend sur toute la longueur du support, avec une vis à oreilles en bas. Une plate-forme est fixée sur le dessus du support, de 25 mm X 40 mm X 10 mm, avec un trou de 3,5 mm de diamètre aligné avec la rainure du support.
- Réseaux de LED (voir Figure 1).
- Quatre bras de tuyau de liquide de refroidissement, d’une longueur de ~18 cm, sont fixés à la base de la plate-forme à l’aide du connecteur de tuyau de liquide de refroidissement. Le tuyau de liquide de refroidissement est utilisé uniquement comme support structurel et n’est pas utilisé à des fins de refroidissement.
- Des rainures correctement espacées sont découpées dans la dernière pièce de tuyau de liquide de refroidissement de chaque bras pour fixer un dissipateur thermique à l’extrémité de chaque bras.
- Une LED bleue Rebel Tri-Stars est montée sur chaque dissipateur thermique à l’aide de ruban adhésif thermique prédécoupé. Un Carclo 18° Tri-lens est apposé sur chaque Tri-Star.
- Les LED Tri-Stars sont câblées aux pilotes BuckPuck DC et à une alimentation comme spécifié. Nous avons organisé notre installation avec chaque BuckPuck alimentant deux Tri-Star en série.
- L’éclairage des quatre LED Tri-Stars à 700 mA a donné un irradiance de 713 W/m2 sur notre plate-forme.
- Appareil photo : L’appareil photo est monté sur un petit trépied et mis au point sur le haut de la plate-forme.
4. Essai comportemental
- Anesthésier brièvement les mouches sur la glace.
- Placez les mouches individuelles dans les pointes de pipette, en utilisant du ruban adhésif pour fermer les deux extrémités de la pointe.
- Une fois que les mouches se sont réveillées et explorent activement la pointe de la pipette, retirez le ruban et placez une pipette dans la rainure du support vertical. La vis moletée est utilisée pour fixer la pointe de la pipette en place et pour fermer le bas de la pointe.
- Pendant que la mouche explore la pointe de la pipette (généralement 30 à 60 secondes), démarrez l’enregistrement de la caméra juste avant que la mouche n’émerge de la pointe sur la plate-forme.
- Une fois que la mouche est apparue sur la plate-forme, attendez 1 à 2 secondes et allumez les LED bleues. Utilisez une minuterie pour mesurer manuellement le temps jusqu’à ce que la mouche commence le vol.
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