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Ce protocole est un extrait de Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).
NOTE : Si ce protocole est utilisé pour la première fois pour isoler les ISC par tri FAC, les contrôles suivants sont obligatoires afin de définir initialement correctement les paramètres FACS : Cellules dissociées de l’intestin moyen de la drosophile de type sauvage (par exemple w1118) sans Sytox. Cellules dissociées de l’intestin moyen de la drosophile de type sauvage (par exemple w1118) avec Sytox (voir étape 3.6). Cellules dissociées de l’intestin moyen de la lignée de mouche esg-Gal4, UAS-GFP sans Sytox.
1. Préparation des solutions et des plats pour la dissection intestinale
- Préparez 4 à 6 flacons contenant chacun 40 mouches femelles de la ligne de mouches esg-Gal4, UAS-GFP.
- À partir d’une solution mère 10x PBS, préparer 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH2PO4·H2O, 8,4 mM Na2HPO4·2H2O, 175 mM NaCl, ajuster le pH à 7,4).
- Préparer une solution d’agarose à 3,5 % dans 1 PBS (3,5 g d’agarose par électrophorèse dans 100 ml, 1 PBS). Préparez les plaques de dissection en versant cette solution dans des boîtes de Pétri (diamètre 8,5 cm) pour couvrir le fond. La couche d’agarose empêche d’endommager les pointes de la pince pendant la procédure de dissection. Une fois le gel solidifié, stockez les plaques de dissection à 4 °C.
- Préparez 300 ml de 1x PBS + 1 % BSA frais avant de disséquer et placez le flacon sur de la glace ou à 4 °C.
- Allumez la centrifugeuse et laissez-la refroidir à 4 °C.
- Flambez les pointes de 2 pipettes Pasteur en verre pour lisser les bords.
- Nettoyez deux paires de pinces et une lame de rasoir avec de l’éthanol à 70 %.
- Placez quatre à six tubes de microcentrifugation de 1,5 ml pour recueillir des intestins moyens disséqués sur de la glace.
2. Préparation du tractus gastro-intestinal et dissection de l’intestin moyen
- Anesthésiez les mouches d’un flacon (40 mouches) avec du CO2 sur un lit de mouches standard, décapitez toutes les mouches à l’aide d’une lame de rasoir et transférez-les dans la boîte de dissection. Versez une solution froide de 1 PBS/1 % de BSA dans la boîte de dissection pour couvrir le gel d’agarose. Les mouches flottent.
- Saisissez l’abdomen de la mouche avec une paire de pinces, tout en tenant le thorax avec l’autre paire de pinces. Séparez le thorax de l’abdomen. L’intestin sera visible et l’intestin antérieur/le jabot sera très probablement encore relié au thorax.
- Saisissez l’intestin et retirez-le du thorax. Pour déplier l’intestin, saisissez la cravache et tirez légèrement l’intestin vers l’avant de l’abdomen.
- Saisissez l’extrémité postérieure de l’abdomen avec une paire de pinces et le bord de la cuticule ouverte antérieurement avec l’autre paire de pinces. Veillez à ne pas détruire le tissu intestinal saillant. Tirez l’extrémité postérieure vers l’extérieur pour casser la cuticule et continuez à tirer vers l’arrière très doucement jusqu’à ce que tout l’intestin ait été retiré de la cavité abdominale. Il peut être nécessaire d’enlever le jabot au préalable s’il est trop gros pour passer dans la cavité corporelle.
- Retirez l’intestin antérieur, les tubules de Malpighian, l’intestin postérieur et les ovaires en laissant l’intestin moyen nu.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez le lot d’intestins moyens disséqués dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml contenant une solution froide de 1x PBS/1 % BSA et maintenez le tube sur de la glace. Les échantillons doivent être traités dans les 2 heures.
- Une fois la dissection d’un lot entier terminée, rincez le plat de dissection avec de l’eau distillée deux fois pour éliminer les débris restants. Commencez à disséquer le prochain lot de midguts (répétez les étapes 2.1 à 2.7). Disséquez autant de lots que possible dans les 2 heures, puis passez à l’étape 3.1.
3. Digestion du tissu intestinal pour récolter les cellules pour le tri FAC
- Retirez la solution 1x PBS/1 % BSA de l’intestin moyen et ajoutez 500 μl de solution de trypsine-EDTA à 0,5 % à chaque échantillon.
- Agitez bien pendant 20 secondes et incubez les échantillons en les balançant doucement à 20 tr/min à température ambiante pendant 25 à 30 minutes.
- Vortex à nouveau après environ 30 minutes et laissez le tissu intact de l’intestin moyen couler au fond du tube. Retirez soigneusement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette Pasteur en verre flammé et filtrez-les à travers une maille en nylon de 35 μm dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
- Faites tourner les cellules à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Il est à noter que lorsque vous commencez la digestion, une pastille cellulaire peut ne pas être visible au début, mais elle le deviendra au fur et à mesure que la digestion des tissus progresse.
- Transférez soigneusement la solution de trypsine dans le tube d’échantillon d’origine contenant le tissu intact de l’intestin moyen restant. Évitez de transférer trop de cellules de la pastille.
- Remettez doucement en suspension la pastille de cellule dans 400 μl de 1x PBS/1 % BSA froid. Gardez les tubes de microcentrifugation contenant les cellules dissociées sur de la glace et couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour protéger les cellules de la lumière.
- Vortex la solution de trypsine contenant le tissu de l’intestin moyen intact restant et placez les échantillons sur le rocker pendant encore 30 minutes à température ambiante.
- Répétez les étapes 3.3 à 3.4.3 jusqu’à ce que tout le tissu de l’intestin moyen ait été digéré. Combinez les cellules dissociées de tous les tubes de microcentrifugation en un seul tube de microcentrifugation. Cela peut nécessiter une étape de centrifugation comme au point 3.4, car le volume de toutes les suspensions cellulaires combinées peut dépasser 1,5 ml. Gardez la suspension cellulaire sur de la glace et protégez-les de la lumière.
- Faites tourner les cellules dissociées à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez avec précaution la plus grande quantité possible de surnageant, en laissant environ 50 à 100 μl de la solution 1x PBS/1 % BSA dans le tube de microcentrifugation. Remettre doucement en suspension les cellules dissociées dans 800 μl de 1x PBS/1 % BSA contenant Sytox (1:20 000).
- Transférez la suspension cellulaire dans un tube Falcon à fond rond de 5 ml en filtrant les cellules à travers un capuchon à pression de crépine de cellule (maille de nylon de 35 μm). Conservez toujours les échantillons cellulaires sur de la glace et à l’abri de la lumière. Les cellules sont maintenant prêtes à être triées.
- Pipeter 600 μl de solution d’ARN dans chaque tube de microcentrifugation dans lequel les cellules seront triées pour l’isolement ultérieur de l’ARN. Pour d’autres applications en aval, les cellules peuvent être collectées dans une solution différente, par exemple dans du PBS stérile.