Ce protocole est un extrait de Vogler et Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Avant de commencer
- Préparez une solution d’hémolymphe artificielle (AH) contenant 108 mM de Na+, 5 mM de K+, 2 mM de Ca2+, 8 mM de MgCl2, 1 mM de NaH2PO4, 4 mM de NaHCO3, 10 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM d’HEPES (pH 7,1, tous des réactifs de Sigma Chemicals). Le saccharose et le tréhalose doivent être ajoutés à l’AH à partir de solutions mères réfrigérées juste avant l’utilisation afin d’éviter la contamination bactérienne.
- Amenez AH à température ambiante et oxygénez la solution en faisant bouillonner l’air pendant au moins 15 min.
- Tirez plusieurs capillaires fins (par exemple des capillaires en verre, 100ul, VWR) nécessaires à l’élimination de la graisse.
2. Cœur de drosophile semi-intact de la mouche adulte
- Les mouches drosophiles adultes sont anesthésiées avec Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) pendant 2 à 5 minutes. Il faut veiller à ne pas laisser les mouches dans le Fly Nap pour des expositions plus longues. L’exposition à court terme au froid peut également être utilisée pour anesthésier les mouches, mais le CO2 n’est pas recommandé car il a des effets plus durables sur la fréquence cardiaque et la rythmique.
- Les mouches anesthésiées sont placées, côté dorsal vers le bas, dans une boîte de Pétri recouverte d’une fine couche de vaseline. La cuticule hydrophobe des ailes et du corps « colle » de manière réversible à la gelée, mais la mouche peut être repositionnée si nécessaire. Cela devient particulièrement important lors des manipulations ultérieures.
- Une première coupe est effectuée à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort incurvés (Roboz #5611). Les lames de ciseaux sont placées sous les pattes et inclinées vers la surface dorsale du thorax, près du cou. La tête, le cordon nerveux ventral et les pattes sont enlevés d’une seule coupure. La préparation est ensuite immergée dans une solution oxygénée d’hémolymphe artificielle (AH).
- À l’aide de ciseaux à ressort, l’extrémité postérieure de l’abdomen (composée des segments abdominaux 7 et 8) est retirée en une seule coupe. Cela permet de faire des coupes latérales le long des deux bords de l’abdomen et sert à couper la connexion entre l’intestin postérieur et la cuticule abdominale. Le lambeau libéré de la cuticule abdominale ventrale est ensuite retiré.
- Dans les étapes 3 et 4, les connexions antérieures et postérieures de l’intestin sont sectionnées, de sorte que les organes abdominaux ne sont plus maintenus en place que par des trachéols. L'intestin et les autres organes abdominaux peuvent généralement être retirés en une seule masse à l'aide d'une pince de bijoutier (Roboz, #55) et d'une légère traction. L’ablation des organes internes révèle le tube cardiaque battant toujours attaché à la cuticule dorsale entourée de corps adipeux.
- Les corps adipeux sont assez opaques au microscope optique, par conséquent, il est souvent nécessaire d’enlever une partie de cette graisse afin de voir clairement le tube cardiaque. Ceci est accompli par une technique de liposuccion utilisant des capillaires en verre finement étirés. Les capillaires sont fabriqués à l’aide d’un extracteur de pipette standard (par exemple Sutter P-97 Pipette Puller) et sont ensuite insérés dans un tube en plastique (Tygon, 1/16") fixé à une source de vide. Ce système est utilisé pour aspirer l’excès de graisse autour du tube cardiaque. La force d’aspiration est proportionnelle au diamètre de l’embout, de sorte qu’il ne faut pas utiliser de pipettes dont l’embout a un diamètre supérieur à 40 microns. Des précautions extrêmes doivent être prises pour éviter de toucher le cœur lui-même, et parce que la partie postérieure du cœur est très fragile, cette région doit être évitée complètement.
- Le tube cardiaque de la drosophile adulte est maintenant exposé et devrait battre. Si nécessaire, la cuticule et le cœur attaché peuvent être repositionnés en soulevant doucement la cuticule de la vaseline et en la repoussant soigneusement, en évitant à nouveau tout contact avec le tissu cardiaque. À ce stade, la solution baignant la préparation doit être remplacée par de l’AHL frais. Cette préparation doit être laissée s’équilibrer pendant 20 à 30 minutes avec une oxygénation avant toute manipulation. Si la préparation doit être conservée pendant plus de 60 minutes, elle doit être perfusée avec de l’AHL frais.
