$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ce protocole est un extrait de Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Lay Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).
1. Construction de la chambre, assemblage, configuration du test
- Demandez à un atelier d’usinage de construire des chambres de ponte en acrylique (Figure 1A-D). Le dessin technique de différentes pièces a été présenté dans la figure supplémentaire 1-3. Des images haute résolution peuvent également être trouvées ici (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Insérez des feuilles de plastique dans la pièce de chargement (supérieure) de la chambre comme indiqué dans Figure 1C. Cela sert de surface inférieure lors du chargement des mouches dans les arènes de ponte individuelles.
- Anesthésiez les femelles sur un tampon de CO2 et chargez-les individuellement dans chaque arène de ponte. Attendez ~30 min pour que les mouches se remettent du CO2 et s’acclimatent au nouvel environnement.
- Préparez les substrats d’agarose.
- Pour plus de commodité, conservez une bouteille préfabriquée d’agarose fondue à 1 % dans un bain-marie à 55 °C.
- Ajouter la quantité désirée de solution mère de saccharose (2 M) dans un tube conique de 50 ml et la mélanger avec la quantité appropriée d’agarose. Par exemple, pour préparer le substrat de saccharose de 150 mM, placez 750 μl de solution de saccharose 2 M dans le tube, puis remplissez le tube d’agarose jusqu’à ce qu’il atteigne le repère de 10 ml.
- Préparez le substrat ordinaire de la même manière, mais ajoutez de l’eau distillée au lieu de la solution de saccharose.
REMARQUE : La concentration finale d’agarose dans ce protocole est légèrement inférieure à 1 %. D’après notre expérience, la concentration exacte d’agarose n’a pas d’importance tant qu’elle est contrôlée pour être comprise entre ~0,9 et 1,1 % et que les deux substrats ont la même concentration d’agarose.
- Prenez le morceau de substrat (inférieur) de la chambre et pipetez 1 000 μl de substrat d’agarose dans chaque auge, comme on le voit dans Figure 1D.
- Laisser l’agarose se solidifier pendant ~30 min.
- Une fois que les substrats d’agarose et les mouches sont prêts, assemblez les trois pièces de la chambre de ponte, puis retirez les feuilles de plastique.
- Placez les chambres dans des incubateurs à mouches.
REMARQUE : La durée des expériences de ponte peut varier en fonction des besoins expérimentaux. Nous menons généralement l’expérience O/N (14 à 16 heures). De plus, aucun impact significatif du rythme circadien sur les préférences de ponte n’a été observé.
- Anesthésier les femelles en injectant du CO2 dans la chambre. Démontez la chambre, jetez les mouches anesthésiées dans la morgue à mouches (c’est-à-dire une canette de café vide remplie d’huile de maïs). Prenez des photos des résultats pour l’archivage (voir Figure 2).
- Comptez le nombre d’œufs manuellement et calculez les indices de préférence pour l’analyse. Calculerl’indice de préférence comme suit : (N a - Nb)/(Na + Nb) où Na et Nb représentent le nombre d’œufs sur le site a par rapport au site b, respectivement.
D) Le substrat (en bas) et les pièces de séparation (au milieu) de la chambre. L’agarose est déposée dans des auges individuelles pour servir de substrats de ponte (flèches). Un quadrilatère délimite l’arène de ponte d’une seule mouche. (E) Jour 0 des femelles...