C. elegans Dissection de blastomères : procédé d’extraction de la coquille d’œuf et de dissociation de cellules embryonnaires

Résumé

Source : Hsu, C. R., et al. Reconstitution in vitro de motifs de contact cellulaire spatial avec des blastomères embryonnaires isolés de Caenorhabditis elegans et des billes de polystyrène adhésives.J. Vis. Exp.(2019).

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler les blastomères de C. elegans des embryons précoces. Les cellules résultantes conviennent à la culture cellulaire ou aux expériences ex vivo.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Hsu et al, Reconstitution in vitro des modèles de contact cellulaire spatial avec des blastomères embryonnaires isolés de Caenorhabditis elegans et des billes de polystyrène adhésives, J. Vis. Exp.(2019).

1. Isolement d’un blastomère embryonnaire
2. Portez des gants et une blouse de laboratoire pour éviter les coupures et le contact avec la solution de blanchiment.
   1. Tenez chaque extrémité d’un microcapillaire (capacité ; 10 μL) avec la main droite et la main gauche.
   2. Tirez le microcapillaire vers les deux extrémités pour appliquer une tension et amenez le centre du capillaire au-dessus d’un brûleur pour former deux capillaires tirés à la main (Figure 1A).
   3. Coupez les extrémités des capillaires tirés à la main à l’aide d’une pince sous le microscope à dissection et fixez le capillaire tiré dans un appareil de pipetage buccal. Préparez deux types de pipettes. La taille de l’ouverture de la pointe des pipettes doit être d’environ 2x et 1x la longueur de l’axe court des embryons de C. elegans (30 μm) pour le transfert d’embryons et l’extraction de la coquille d’œuf, respectivement Figure 1B-D).
   4. Pipeter 45 μL de solution saline d’œuf dans un puits d’une lame à plusieurs puits (figure 2A ; en bas).
   5. Placez 5 à 10 C. elegans adultes dans une solution de sel d’œuf bien contenue.
   6. Pour obtenir des embryons précoces de C. elegans, coupez les adultes en morceaux en positionnant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en faisant glisser les aiguilles l’une à côté de l’autre (figure 2A ; schémas supérieurs).
   7. Pipeter 45 μL de solution d’hypochlorite dans un puits à côté du puits contenant la solution de sel d’œuf (figure 2B).
   8. Pipeter 45 μL de milieu de croissance de Shelton dans les trois puits suivants à côté du puits contenant la solution d'hypochlorite (figure 2B).
   9. Transférez les embryons au stade 1 cellule et au stade précoce 2 cellules dans la solution d’hypochlorite par pipetage buccal avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d’embryons (figure 2B).
   10. Attendez 40 à 55 s.
   11. Lavez les embryons en transférant les embryons de la solution d'hypochlorite dans le milieu de croissance de Shelton par pipetage buccal avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 2B).
   12. Lavez à nouveau les embryons en transférant les embryons dans un nouveau puits de milieu de croissance de Shelton par pipetage buccal avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 2B).
   13. Transférez les embryons lavés dans un nouveau puits de milieu de croissance de Shelton par pipetage buccal avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons. À l’aide du capillaire dessiné à la main pour l’extraction de la coquille d’œuf, répétez soigneusement le pipetage (figure 2C ; schémas du milieu). Si la coquille de l’œuf est retirée avec succès, les cellules embryonnaires deviendront plus sphériques (Figure 2C ; à droite).
   14. Séparez les blastomères embryonnaires à 2 cellules en les pipetant doucement et continuellement avec le capillaire dessiné à la main pour l’élimination de la coquille de l’œuf (figure 2D).

Figure 1 : Isolement des blastomères.(A) Tirage à la main d’un capillaire en verre. (B) Capillaire en verre dessiné à la main pour le transfert d’embryons. (C) Capillaire en verre étiré à la main pour l’enlèvement de la coquille des œufs. (D) Schémas montrant la taille appropriée de l’ouverture capillaire pour l’enlèvement de la coquille de l’œuf. Les flèches indiquent les embryons. Les barres d’échelle indiquent 100 μm.

Figure 2 : Flux de travail d’isolation des blastomères.(A) Dissection de C. elegans adultes dans un tampon de sel d’œuf pour obtenir des embryons. Des photographies montrent des embryons aux stades 2 et 4 cellules avant l’ablation de la coquille de l’œuf. (B) Traitement et lavage à l’hypochlorite. (C) Les schémas décrivent le moment approprié pour l’enlèvement de la coquille des œufs. La photo montre un embryon au stade 4 cellules après l’ablation de la coquille de l’œuf. (D) Séparation des blastomères. La photographie montre un embryon séparé au stade 2 cellules. Les tailles des flèches en C et D indiquent les forces relatives requises lors du pipetage. Les barres d’échelle indiquent 50 μm.

Matériaux

à usage général et Precision Glide, calibre 25

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ensemble de tube d’aspirateur	Pour l’isolement des blastomères.
Caenorhabditis elegans souche : N2, de type sauvage	Centre de Génétique Caenorhabditis	N2	Souche utilisée dans cette étude
Caenorhabditis elegans souche : KSG5, génotype : zuIs45 ; itIs37	en interne	KSG5	Souche utilisée dans cette étude
Mircopipets calibrés, 10 μL	Drummond	Référence 21-180-13	Pour l’isolement des blastomères
CD Concentré lipidique	Technologies de la vie	11905031	Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Clorox	Clorox	N. A.	Pour l’isolement des blastomères. Ouvrez une nouvelle bouteille lorsque le traitement à l’hypochlorite ne fonctionne pas bien.
Support de lamelle	En interne	N.A.	Pour l’isolement des blastomères.
Microscope de dissection : Zeiss Stemi 508 avec support M. La source de lumière est une LED intégrée. Le grossissement de l’oculaire est de 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Pour l’isolement des blastomères.
Sérum fœtal bovin, One Shot qualifié, origine Canada	Gibco	A3160701	Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Bd	14-826AA	Pour l’isolement des blastomères
Inuline	Alfa Aesar	AAA1842509	Pour l’isolement des blastomères
MEM Solution vitaminique (100x)	Gibco	11120052	Pour l’isolement des blastomères.
Multitest Slide 10 Puits	MP Biomédical	ICN6041805	Pour l’isolement des blastomères
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140148	Pour l’isolement des blastomères.
Polyvinylpyrrolidone	Bioréactifs Fisher	BP431-100	Pour l’isolement des blastomères
Chlorure de potassium	Boutique bio	Réf. POC888	Pour l’isolement des blastomères
Gibco	21720024	Pour l’isolement des blastomères. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.
Chlorure de sodium	Boutique bio	SOD001	Pour l’isolement des blastomères
solution d’hydroxyde de sodium, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Pour l’isolement des blastomères
Filtres pour seringues, PTFE, non stériles	Basix	13100115	Pour l’isolement des blastomères.
Tygon S3,, Formulation E-3603, Diamètre intérieur 3.175 mm	Plastiques Saint Gobain Performance	Référence 89403-862	Pour l’isolement des blastomères.
Tygon S3,, Formulation E-3603, Diamètre intérieur 6,35 mm	Plastiques Saint Gobain Performance	Référence 89403-854	Pour l’isolement des blastomères.

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