Le protocole suivant est un extrait de Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).
- Préparation d’organismes expérimentaux
- Choisir 10 nématodes stagés L4 par souche 24 h avant le début de l’essai pour s’assurer que les organismes sont de jeunes adultes au moment de l’essai. Pour chaque nématode mutant ou témoin testé, choisissez 10 L4 (10 pour le témoin et 10 pour le test).
- Maintenir les organismes L4 à l’aide de méthodes standard pendant 24 h sur des plaques de gélose standard ensemencées avec OP50 Escherichia coli. Si des organismes sont perdus au cours des étapes de lavage suivantes, compensez en augmentant la taille de l’échantillon de départ (c’est-à-dire choisir 20 vers au lieu de 10).
REMARQUE : Le comportement est un phénotype intrinsèquement variable. Effectuez la méthode en trois exemplaires pour chaque souche sur trois jours distincts. Inclure des souches témoins et des conditions supplémentaires pour les souches nouvelles, comme il est souligné dans la section de discussion.
- Immédiatement avant le test, transférez les organismes expérimentaux dans une plaque de gélose sans bactéries et laissez les nématodes se déplacer librement pendant 1 minute pour éliminer l’excès de bactéries.
- Si les organismes expérimentaux ont été contaminés au cours des 24 heures précédant l’essai, jetez-les.
- Pipeter 1 mL de M9 sur la plaque exempte de bactéries pour laver les vers dans un tube de microcentrifugation.
- Centrifuger à 3 000 x g pendant 1 min. Les vers doivent former une pastille au fond du tube. Aspirez la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 mL de M9 à la pastille de vis sans fin, retourner le tube pour mélanger les vers avec la solution.
- Répétez l’étape 1.4 trois fois de plus.
- Si l’excès de bactéries a d’abord été transféré avec les vers, répétez l’opération 5 fois au total. Aucune bactérie ne doit être transférée sur les plaques de course alimentaire en cuivre. Si des aliments sont transférés sur la plaque d’essai, cela interférera avec la collecte de données précises.
- Après le lavage final, aspirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 100 μL de M9 et que la pastille de vis sans fin reste.
Attention : Les comportements liés à la famine deviennent évidents après 30 min. Par conséquent, les vers doivent être immédiatement retirés de la solution une fois les étapes de lavage terminées.
- Préparation des plaques de dosage
- Préparez des plaques de gélose NGM standard deux jours avant le dosage.
- Si les plaques sont conservées dans un environnement humide, préparez les plaques de gélose 3 jours avant le dosage. Vous pouvez également retirer le couvercle de la plaque pendant 3 à 6 h pour assurer une bonne sécheresse (si vous êtes dans un environnement stérile).
- À l’aide d’un marqueur permanent épais, tracez une ligne sur la face inférieure de la plaque le long du bord extérieur et une autre pour former une barrière médiane (Figure 1). La barrière médiane doit être équidistante de chaque bord de la plaque. Utilisez une règle pour assurer des mesures précises. Ces lignes serviront de guide lors du transfert des bactéries et de la solution de cuivre. À condition que E. coli soit transféré avant la solution de cuivre, ces lignes serviront d’indicateurs.
- Plaque de semence avec 50 μL d’OP50 E. coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme (figure 2). La concentration bactérienne doit rester constante d’un essai à l’autre ; Cependant, peu de variabilité a été observée en réponse à de légères différences de concentration.
- Utilisez les lignes marquées sur la face inférieure de la plaque pour vous assurer que les bactéries n’entrent pas en contact avec la solution de cuivre. À condition que la solution de cuivre tapisse le bord de la plaque et forme une barrière médiane, transférez les bactéries de manière à ce que la solution de cuivre n’entre pas en contact avec la source alimentaire.
- Marquez une deuxième série de plaques et n’y transférez aucun E. coli OP50 (Figure 2). Ces plaques serviront à évaluer le contrôle négatif. Ces plaques doivent également avoir un marquage sur une moitié de la plaque pour indiquer l’origine initiale du transfert.
- Laissez sécher les bactéries puis incubez les plaques à 37 °C pendant la nuit. Assurez-vous que les taches bactériennes ne sont pas perturbées lors du transfert dans un incubateur ou une pièce à 37 °C. Une perturbation excessive pourrait modifier l’emplacement ou la forme du champ de nourriture.
- Dosage de la chimiotaxie
- Préparez fraîchement une solution de sulfate de cuivre (II) 0,5 M avant le début de l’essai. À condition d’utiliser 125 μL de la solution par plaque, augmenter ce volume en fonction du nombre de plaques de dosage utilisées (par exemple, 5 plaques de dosage, 625 μL).
- Pipeter 100 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) sur le bord de la gélose pour créer une barrière externe de cuivre. Le dessous marqué de l’assiette doit servir de guide.
- Pipeter 25 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) pour créer une barrière médiane.
- Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre (II) n’entre pas en contact avec le patch bactérien. Utilisez une technique tachetée car les stries peuvent affecter la locomotion en raison d’indentations/égratignures sur l’agar.
- Laissez la solution de cuivre sécher sur la plaque. La période peut varier en fonction des conditions de la plaque et du laboratoire. Vérifiez visuellement la sécheresse toutes les 5 minutes après le transfert.
REMARQUE : La solution de cuivre présente une teinte bleuâtre et est facilement identifiable. Utilisez un mouchoir de laboratoire pour tamponner légèrement la solution près du bord de la plaque afin de discerner la sécheresse.
- Pipetez 20 μL de la pastille de ver du bas du tube sur la moitié exempte de bactéries de la plaque de dosage.
- Assurez-vous que 10 vers sont transférés sur la plaque de dosage. Si des vers supplémentaires ont été accidentellement inclus, retirez-les en les cueillant avec de l’huile d’halocarbure pour vous assurer qu’aucune bactérie n’est ajoutée à la plaque. Chaque essai doit comporter un nombre constant de nématodes au cours de l’essai.
REMARQUE : Si trop peu de vers sont transférés pendant les essais, l’augmentation de la taille initiale de l’échantillon atténuera les pertes potentielles pendant les lavages et les transferts.
- Retirez l’excédent de M9 de la plaque à l’aide d’un mouchoir de laboratoire. M9 ne doit pas entrer en contact avec la solution de sulfate de cuivre (II).
Attention : Assurez-vous que les vers et la surface de la gélose ne sont pas affectés pendant l’exécution de cette étape. S’il est utilisé trop durement, le tissu de laboratoire peut créer des indentations à la surface de la gélose de la plaque et peut éliminer les vers. Les vers supprimés accidentellement via KimWipe doivent être jetés.
- Une fois que la solution M9 a été retirée et que tous les vers ont commencé à produire des schémas locomoteurs non liquides, démarrez le chronomètre du dosage.
- De manière optimale, retirez la solution M9 dans la minute. Le paramètre essentiel est l’identification de la locomotion sinusoïdale. Les vers se déplacent différemment, par exemple en se débattant plutôt qu’en étant sinusoïdaux, lorsqu’ils sont liquides. Démarrez le chronomètre du test une fois que chacun des organismes expérimentaux cesse de se débattre.
- Vérifier les plaques de dosage toutes les 30 min.
- Pour les plaques de test avec des plaques bactériennes, notez positivement les organismes s’ils atteignent la parcelle alimentaire sur une période de 4 heures. Pour les plaques de contrôle négatives, notez positivement les organismes s’ils ont franchi la barrière.
