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Ce protocole est un extrait de Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imagerie calcique
- Utiliser des souches transgéniques exprimant des capteurs calciques génétiquement codés tels que HBR16 (goeIs5[pnmr-1 ::SL1-GCaMP3.35-SL2 ::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Utilisez un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à grand champ. Connectez la sortie TTL de la caméra EMCCD à l’entrée TTL de la LED, de sorte que chaque fois que la caméra enregistre une image, l’échantillon sera éclairé. Utilisez un temps d’exposition d’environ 5 ms. Utilisez un gain EM compris entre 50 et 300.
- Spécifiez une séquence en rafale d’une durée de 24 heures, chaque ver étant imagé toutes les 15 à 30 minutes, d’abord pendant 20 secondes avec DIC, puis pendant 20 secondes avec une fluorescence GFP pour enregistrer GCaMP, puis prenez une image finale du signal mKate2 pour contrôler les niveaux d’expression. Utilisez une fréquence d’images de 2/s lors de chaque rafale.
- Pour l’inspection visuelle des données, utilisez une carte en fausses couleurs pour améliorer la visibilité des petits changements d’intensité de fluorescence. Tracer les données de fluorescence sous la forme ΔF/F, F étant la valeur de référence moyenne de la fluorescence. Une description détaillée de l’analyse des données sur le calcium peut être trouvée dans la littérature.