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Ce protocole est extrait de Teoh et al, Approches quantitatives pour l’étude des structures cellulaires et de la morphologie des organites chez Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Quantifier la structure musculaire de la paroi corporelle
- Imagerie par fluorescence de la structure musculaire de la paroi corporelle
- Obtenir une souche (par exemple, RW1596) porteuse du transgène stEx30(Pmyo-3 ::gfp ::myo-3 + rol-6(su1006)), qui marque les fibres de myosine avec GFP.
REMARQUE : L’introduction du transgène chez les animaux peut être réalisée soit en croisant une souche d’intérêt avec des animaux qui expriment déjà le transgène, soit en micro-injectant de l’ADN dans le bras distal de la gonade. Le phénotype « roulant » induit par la mutation rol-6 dans ce transgène facilite la visualisation des muscles. Les muscles de la paroi corporelle longent les côtés dorsal et ventral qui sont normalement exclus chez les animaux de type sauvage car ils se trouvent généralement sur l’un de leurs côtés latéraux. L’allèle rol-6(su1006) induit une torsion des animaux, exposant ainsi certaines cellules musculaires pour l’imagerie.
- Imagez les animaux à l’aide d’un microscope à fluorescence couplé à une caméra CCD (High Resolution), à un objectif 40X ou supérieur, à un filtre GFP et à un logiciel d’acquisition.
- Ajustez le temps d’exposition et l’intensité de l’éclairage pour éviter les images sursaturées.
- Capturez et enregistrez des images des muscles (grossissement 400X) d’une section de l’animal contenant au moins une cellule musculaire oblique visible complète. Évitez les régions avec une seule cellule musculaire incomplète ou les sections floues. Excluez également les images provenant des régions antérieures et postérieures extrêmes, ainsi que des régions adjacentes à la vulve.
REMARQUE : Si l’animal n’a pas une seule cellule musculaire complète visible, faites glisser doucement la lamelle pour retourner l’animal de manière à exposer une cellule complète.
- Mesure de la surface des cellules musculaires
- Ouvrez l’image dans le logiciel Fidji (la version 2.0.0 a été utilisée dans cette étude).
- Utilisez la sélection de polygones pour tracer soigneusement autour d’une seule cellule musculaire oblique. Ajustez la ligne du polygone à la fin en faisant glisser le point d’ancrage pour améliorer le traçage.
- Allez dans l’onglet Analyser en haut du logiciel et cliquez sur Mesurer pour calculer la surface de la sélection. Un tableau de résultats séparé contenant la surface et d’autres mesures sera affiché. Si la mesure de surface est absente de la table des résultats, allez dans Définir les mesures sous l’onglet Analyser et vérifiez que la case de surface est cochée. De même, décochez les autres mesures qui ne sont pas nécessaires.
- Pour les cellules musculaires avec une région dégénérée/manquante, tracez la région manquante avec l’outil de sélection de polygone et cliquez à nouveau sur Mesurer. S’il y a plusieurs espaces dans la cellule, tracez chaque espace séparément.
- Calculez le rapport entre l’aire de l’espace et l’ensemble de la cellule musculaire unique. Un rapport élevé indique une plus grande étendue de dégénérescence musculaire due à de grands espaces à l’intérieur de la cellule. S’il n’y a pas de régions manquantes, comme on le voit couramment chez les animaux de type sauvage, le rapport serait calculé comme étant zéro.
REMARQUE : À titre de contrôle, notez également visuellement les défauts de la structure musculaire et comparez les résultats avec la mesure quantitative. Ceci est particulièrement utile si la souche est étudiée pour la première fois en laboratoire. Pour la notation phénotypique, évaluer les animaux comme étant défectueux ou non défectueux en fonction de l’intégrité des filaments. Par exemple, les animaux présentant une perte de stries de filaments distinctes, une agglutination de la GFP ou des espaces dans les cellules musculaires dus à une dégradation structurelle seraient considérés comme défectueux.