Blessure épidermique au laser : induire des lésions localisées pour examiner les processus de réparation chez C. elegans

Résumé

Source : Xu, S. et Chisholm, A. D. Méthodes de plaie cutanée et tests de réponse aux plaies chez C. elegans.J. Vis. Exp.(2014).

Cette vidéo présente une méthode de blessure au laser, qui est utilisée pour causer des blessures très précises dans l’épiderme du ver. L’exemple de protocole est issu d’une étude de la réponse et de la réparation des plaies.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Xu et Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Blessure au laser

REMARQUE : Utilisez l’irradiation laser femtoseconde (800 nm) pour effectuer des blessures plus précises.

1. Préparez des tampons de gélose sur une lame de verre avec de l’agar-gélose fondue à 2 %. Assurez-vous que les tampons sont similaires aux tampons gélosés utilisés pour l’imagerie en direct de C. elegans.
2. Transférez 10 jeunes vers adultes sur le tampon d’agarose avec un cure-vis et ajoutez une goutte de 2 μl de solution de lévamisole de 12 mM. Couvrez les animaux et le liquide avec une lamelle. Attendez 1 à 2 minutes pour que les vers se paralysent.
3. Placez la lame de verre sur un microscope confocal à disque rotatif. Déplacez la platine pour trouver les vers et concentrez-vous sur l’épiderme syncytial latéral, antérieur ou postérieur avec un objectif 100X (NA 1,4-1,46).
4. Réglez la puissance du laser femtoseconde sur 140 mW (mesurée avant l’objectif). Utilisez le laser femtoseconde à une fréquence de répétition de 80 MHz.
   REMARQUE : Deux impulsions de 200 ms chacune (séparées de 20 ms) sont suffisantes pour blesser nos mains.
5. Concentrez-vous sur la surface apicale de la cellule épidermique et blessez l’épiderme. Observez la perturbation locale du cytoplasme (bouillonnement) ou le blanchiment local de tout marqueur fluorescent utilisé.
   REMARQUE : Suivez les procédures de sécurité laser appropriées lors de l’utilisation du laser femtoseconde. Les balayages linéaires ou ponctuels à l’aide de lasers femtosecondes, tels que ceux des microscopes à deux photons, doivent fournir une puissance suffisante pour les blessures au laser.
   REMARQUE : Bien que nous n’ayons pas d’expérience directe de l’utilisation d’autres lasers, en principe, les blessures devraient être possibles à l’aide de lasers UV conventionnels (comme ceux utilisés dans les ablations de cellules de C. elegans). En option, utilisez un module de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) sur disque confocal en rotation pour blesser l’épiderme (N. Pujol, communication personnelle).