Alimentation FITC-Dextran : une méthode pour quantifier la perméabilité intestinale chez C. elegans

Résumé

Source : Le, T. A. N., et al. Mesurer les effets des bactéries et des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode permettant de visualiser et de mesurer l’intégrité de la lumière intestinale de C. elegans en nourrissant les vers avec du dextrane marqué au FITC. L’exemple de protocole montre le test effectué avec des vers traités au 3,3'-diindolylméthane (DIM) et nourris à des agents pathogènes.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Préparation de plaques NGM pour tester les effets d’un produit chimique (DIM) sur la perméabilité intestinale de C. elegans nourri avec P. aeruginosa
   1. Ajouter 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 ml d’eau distillée, un agitateur magnétique et 6,8 g de gélose dans une bouteille en verre de 500 ml (gélose NGM).
   2. Ajouter 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique sans gélose dans une autre bouteille en verre de 500 ml (bouillon NGM).
   3. Autoclavez les deux flacons (étapes 1.1 à 1.2), un flacon en verre vide de 100 ml et un flacon vide en verre de 500 ml pendant 15 min à 121 °C. Ensuite, laissez refroidir le milieu contenant les bouteilles à 55 °C dans le bain-marie pendant 30 min. Gardez le milieu gélosé dans le bain-marie et retirez la bouteille contenant le bouillon (de l’étape 1.2) pour l’étape suivante.
   4. Ajoutez les additifs chimiques au bouillon NGM : 0,4 mL de 1 M CaCl₂, 0,4 mL de cholestérol dans l’éthanol (mL), 0,4 mL de 1 M MgSO₄ et 10 mL de 1 M KPO₄ (tous ces composants doivent être stérilisés à l’exception du cholestérol dans l’éthanol). Ensuite, mélangez soigneusement le mélange à l’aide d’un agitateur magnétique à 55 °C.
   5. Étiquetez la bouteille en verre vide autoclavée de 500 ml avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) et la bouteille en verre vide autoclave de 100 ml avec DIM.
   6. Transférez 50 ml de bouillon NGM dans la bouteille de 100 ml étiquetée DIM. Ajouter 500 μL de stock DIM de 20 mM dans la bouteille et bien mélanger.
      NOTE : Le DIM est dissous dans du DMSO (stock de 20 mM).
   7. Retirez rapidement la gélose NGM du bain-marie, ajoutez 50 ml de gélose NGM dans la bouteille étiquetée DIM et mélangez soigneusement.
   8. Placer une aliquote de 20 mL de milieu NGM contenant du DIM dans chaque boîte de Pétri de 90 mm x 15 mm. Environ cinq plaques NGM contenant du DIM peuvent être fabriquées à partir de cette étape.
      NOTE : La concentration finale de DIM dans chaque plaque NGM sera de 100 μM.
   9. Pour préparer la plaque de NGM contenant du DMSO, transférez 150 ml de bouillon NGM dans la bouteille de 500 ml étiquetée avec du DMSO. Ajoutez 1,5 ml de DMSO dans la bouteille et mélangez bien.
   10. Ajouter 150 ml de milieu gélosé NGM dans la bouteille étiquetée au DMSO et bien mélanger.
   11. Placer une aliquote de 20 mL de milieu NGM contenant du DMSO dans chaque boîte de Pétri de 90 mm x 15 mm. Une quinzaine de plaques NGM contenant du DMSO peuvent être fabriquées à partir de cette étape.
       REMARQUE : La concentration finale de DMSO dans chaque plaque NGM sera de 0,5 %.
   12. Solidifiez les plaques à température ambiante pendant au moins 3 h et conservez-les à 4 °C jusqu’à utilisation.
       NOTE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   13. Retirer la culture d’E. coli OP50 ou de P. aeruginosa PAO1 du réfrigérateur à 4 °C et agiter correctement la culture avant de l’étaler sur les plaques NGM.
   14. Placez 800 μL de culture bactérienne E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 sur chaque plaque de gélose NGM fraîche et laissez sécher les plaques dans un incubateur à 20 °C pendant la nuit.
       NOTE : Le protocole peut être mis en pause ici. Pour la troisième expérience (figure 1), deux plaques NGM contenant du DMSO recouvertes d’E. coli OP50 vivant, une plaque NGM contenant du DMSO recouvertes de P. aeruginosa PAO1 vivant et une plaque NGM contenant du DIM recouvertes de P. aeruginosa PAO1 vivant ont été préparées.
2. Traitement des bactéries ou alimentation DIM et FITC-dextran
   1. Incuber les œufs synchronisés selon l’âge à 20 °C pendant 64 h sur des plaques NGM complétées par E. coli OP50 vivant comme nourriture.
   2. Lavez la larve L4 synchronisée avec l’âge synchronisé avec le tampon S et transférez-la (plus de 500 vers environ) dans les plaques NGM de traitement contenant différentes bactéries et produits chimiques. Incuber à 20 °C pendant 48 h
      REMARQUE : Le temps de traitement peut varier de 24 à 72 h, selon les bactéries et les produits chimiques utilisés. L’effet thérapeutique ou préventif du DIM peut également être évalué en prétraitant les vers avec des agents pathogènes, puis en traitant les vers avec du DIM (l’effet thérapeutique) ou en prétraitant les vers avec du DIM puis en traitant avec des agents pathogènes (l’effet préventif).
   3. Pour préparer les plaques supplémentées en FITC-dextran, mélanger 2 mL d’E. coli OP50 inactivé par la chaleur avec 4 mg de FITC-dextran. Ensuite, répartissez 100 μL du mélange FITC-dextran et E. coli OP50 dans vingt plaques de gélose NGM fraîches (60 mm x 15 mm) et laissez sécher les plaques pendant 1 h sur une paillasse propre><. REMARQUE : La concentration finale de FITC-dextran dans chaque plaque NGM sera de 20 μg/mL.
   4. Préparez cinq plaques NGM contenant E. coli OP50 sans FITC-dextran pour le traitement de contrôle du véhicule. Pour ce faire, répartissez 100 μL d’E. coli OP50 inactivé par la chaleur dans chaque plaque de gélose NGM fraîche (60 mm x 15 mm) et laissez sécher les plaques pendant 1 h sur une paillasse propre.
      NOTE : Pour chaque expérience indépendante, quinze plaques NGM supplémentées en FITC-dextran et cinq plaques NGM sans FITC-dextran sont nécessaires.
   5. Après 48 h de traitement (à partir de l’étape 2.2), lavez les vers avec le tampon S, transférez les vers sur les plaques supplémentées en FITC-dextran et les plaques NGM sans FITC-dextran, et incubez les plaques pendant la nuit (14 à 15 h).
      REMARQUE : Pour chaque groupe de traitement, 5 répétitions de coloration FITC-dextran (ou alimentation de contrôle du véhicule) sont nécessaires.
   6. Lavez les vers avec un tampon S et laissez-les ramper dans la plaque de gélose NGM fraîche pendant 1 h
      NOTE : Pour chaque expérience indépendante, un total de 20 plaques NGM fraîches est nécessaire. Dans cette étape, vous pouvez utiliser la plaque NGM complétée sans ou avec E. coli OP50.
   7. Ajouter 50 μL de solution de formaldéhyde à 4 % dans chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits. Transférez environ 50 vers de chaque plaque NGM dans chaque puits pour les mesures de fluorescence. Après 1 à 2 min, retirez soigneusement tout le formaldéhyde de chaque puits et ajoutez 100 μL de milieu de montage pour enrober les puits.
      NOTE : Une solution de formaldéhyde (4 %) est utilisée pour immobiliser et fixer les vers. Pour chaque groupe de traitement, 5 puits (5 répétitions) sont utilisés pour l’analyse d’images.
3. Imagerie de C. elegans avec le système d’imagerie Opéretta et détermination de la perméabilité intestinale par mesure de l’absorption de fluorescence FITC-dextran
   REMARQUE :La stéréomicroscopie à fluorescence peut être utilisée pour l’analyse d’images à la place du système Operetta.
   1. Capturez des images de fluorescence et mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide du système d’imagerie à haut contenu Operetta et analysez les images avec le logiciel Harmony.
   2. Dans le logiciel Harmony, appuyez sur l’icône Ouvrir le couvercle pour ouvrir le couvercle et mettre la plaque dans la machine.
   3. Configurez les paramètres.
   4. Cliquez sur Configurer, sélectionnez le type de plaque (96 puits corning à fond plat) et ajoutez les canaux (canaux en fond clair et EGFP).
   5. Ajustez la mise en page. Allez dans la sélection Layout, puis sélectionnez Piste et ajustez les paramètres (première image à 1 μm, le nombre de plans est de 10, la distance est de 1 μm).
   6. Sélectionnez l’un des puits de traitement et un champ de capture et appuyez sur Test pour vérifier si les images sont satisfaisantes dans la section Exécuter l’expérience.
   7. Si les photos sont satisfaisantes, retournez à la section Configurer et appuyez sur l’icône Réinitialiser à la fin de l’écran. Ensuite, sélectionnez tous les puits cibles et un nombre approprié de champs de capture.
   8. Allez à nouveau dans Exécuter l’expérience et entrez le nom de la plaque, puis appuyez sur Démarrer pour commencer le traitement.
   9. Pour mesurer l’intensité de la fluorescence, rendez-vous dans la section d’analyse d’image et saisissez l’image. Trouvez la cellule en choisissant le canal EGFP et la méthode B. Ajustez le seuil commun à 0,5, l’aire à >200 μm², le facteur de division à 3,0, le seuil individuel à 0,18 et le contraste à plus de 0,18. Ensuite, calculez les propriétés d’intensité et choisissez la moyenne comme sortie. Appuyez sur l’icône Appliquer pour enregistrer la configuration.
   10. Allez dans la section Évaluation pour mesurer l’intensité en obtenant une carte thermique et un tableau de données. Définissez le paramètre de lecture sur Cellules — Intensité Cellule EGFP Moyenne — Moyenne par puits et démarrez l’évaluation.
       NOTE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   11. Pour extraire les données d’Opérette, cliquez sur le bouton Paramètres et choisissez Gestion des données.
   12. Choisissez Écrire l’archive, puis ouvrez la navigation et sélectionnez le fichier.
   13. Pour sélectionner le fichier, cliquez sur le petit signal + dans le coin gauche, puis cliquez sur Mesure et choisissez Nom de la plaque.
   14. Sélectionnez le fichier et cliquez sur OK.
   15. Sélectionnez le chemin d’accès pour enregistrer le fichier en cliquant sur le signal Parcourir dans le chemin d’accès actif.
   16. Cliquez sur Démarrer pour enregistrer le fichier de données.
       NOTE : Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Analyse statistique de la fluorescence FITC-dextran de C. elegans
   1. Importez les données et calculez la moyenne et l’écart-type (ET) à l’aide d’un logiciel de statistiques.
   2. Analysez la différence significative à l'aide de l'analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de comparaison multiple de Tukey.

Résultats

Figure 1 : L’effet du DIM sur la perméabilité intestinale de C. elegans nourri à P. aeruginosa.Images microscopiques de vers provenant (A) d’E. coli OP50 sans alimentation au FITC-dextran, (B) d’E. coli avec alimentation au FITC-dextran, (C) P<...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3,3'-diindolylméthane	Sigma
SPL Life Sciences, Corée du Sud	Référence 10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	RÉF. 214010
Solution de formaldéhyde	sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)		Type sauvage
Cholestérol	sigma	Réf. C3045
Costa, noire 96 puits avec fond plat transparent, non traitée, sans couvercle en polystyrène	Corning Incorporated	RÉF. 3631
diméthylsulfoxyde	sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Centre de Génétique Caenorhabditis (CGC)
Isothiocyanate de fluorescéine - dextran	sigma	FD10S
Harmony Software	PerkinElmer		Version 3.5
Sulfate de magnésium heptahydraté	Bioréactifs Fisher	Réf. BP2213-1
sigma	Réf. F4680
Operetta CLS Système d’analyse à haut contenu	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	Contrôleur EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Collection coréenne pour la culture des types	KCTC N° 1637
Chlorure de sodium	Bioréactifs Fisher	BP358-1
Stéréomicroscope	Nikon, Japon	SMZ800N