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Le protocole suivant est un extrait de Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Assemblage RNP
- Concevez l’expérience bien à l’avance, en acquérant tous les composants de l’ARN, de l’ADN et des protéines à l’avance. Dans un premier temps, essayez l’un des témoins positifs énumérés dans le tableau 1 et utilisez les réactifs commerciaux décrits dans la table des matériaux pour assurer un plan d’expérience fiable et l’intégrité des matériaux. Pour des conseils supplémentaires sur la planification d’une nouvelle expérience d’édition du génome, consultez les articles sur ce sujet.
REMARQUE : Une fois assemblés comme décrit dans les étapes suivantes, les RNP préparés à l’avance peuvent être stockés à -80 °C.
- Après avoir choisi le gène à cibler, utilisez l’un des outils en ligne gratuits pour concevoir un ARNg optimal. Assurez-vous de cibler un exon si vous espérez générer un KO.
REMARQUE : Ces outils aideront à identifier un site cible avec une séquence PAM adjacente de S. pyogenes, un score de qualité élevé et un score hors cible faible.
- Purifier la protéine Cas9 de S. pyogenes à l’aide de méthodes publiées ou l’acheter auprès d’un vendeur commercial.
- Préparez un tampon Cas9 typique pour la dilution de l’ARN, la préparation des RNP et le stockage des protéines, qui contient 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de KCl, 10 % de glycérol et 1 mM de TCEP. Utilisez toujours de l’eau exempte de nucléases dans des tampons qui seront utilisés pour remettre en suspension ou diluer l’ARN afin d’éviter la dégradation.
- Produisez l’ARN guide (ARNtracr et ARNcr ou ARNsg) par transcription in vitro à l’aide de méthodes publiées, ou achetez-le auprès d’une société de synthèse d’acides nucléiques.
- Si vous insérez un gène, synthétisez ou achetez un modèle d’ADN de donneur.
- Conservez les aliquotes de protéines et d’ARN à -80 °C et décongelez-les sur de la glace immédiatement avant utilisation.
REMARQUE : Chaque gel-dégel diminue légèrement l’efficacité. Des protocoles détaillés en libre accès pour la purification de Cas9 et la transcription in vitro des ARNsg sont disponibles ailleurs.
- Montage : Assemblez le complexe RNP en ajoutant les réactifs suivants afin de créer un volume final de 20 μL (les concentrations finales sont indiquées entre parenthèses) : Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), ARNcr (12 μM), tracrRNA (40 μM), et les matrices de réparation si nécessaire (0,5 μM d’ADNsb ou jusqu’à 350 ng/μL d’ADNdb).
NOTE : L’efficacité d’une réparation médiée par Cas9 est proportionnelle à la concentration de la construction de réparation de l’ADNdb ; Ainsi, plus la concentration du modèle de réparation est élevée, plus la réparation est efficace. Cependant, il a été démontré qu’une injection de mélanges contenant plus de 350 ng/μL d’ADNdb réduit la viabilité des vers injectés. Ainsi, il est préférable d’utiliser jusqu’à 350 ng/μL d’ADNdb dans le mélange pour maximiser l’efficacité de la réparation tout en minimisant sa létalité.
- Ajouter plusieurs ARNc pour cibler plusieurs loci simultanément, au besoin pour l’approche de criblage co-CRISPR/co-conversion. Lorsque vous ajoutez plus d’un ARNcr, ajoutez-les séquentiellement au master mix.
NOTE : La quantité de chaque ARNcr n’a pas besoin d’être la même, et même doubler la concentration totale d’ARNcr dans le mélange maître sans changer la concentration de Cas9 ne semble pas interférer avec la fréquence de mutagénèse à un locus spécifique. Des exemples sont décrits en détail dans Paix et al.
- Mélanger par pipetage et faire tourner la solution RNP à 16 000 x g pendant 5 s pour s’assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
- Incuber la solution à 37 °C pendant 15 m.
- Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 1 min pour granuler les particules qui pourraient obstruer l’aiguille de micro-injection à alésage fin. Utilisez le surnageant dans les étapes suivantes.
- C. elegans Préparation
1. 1 jour avant la micro-injection : Préparez les coussinets d’agarose pour la microinjection.
- Préparez une solution d’agarose à 3 % (p/v) dans l’eau en ajoutant de l’agarose à l’eau et en portant la solution à ébullition sur une plaque chauffante ou au micro-ondes.
- Disposez des lames de verre de couverture de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm sur une table et utilisez une pipette Pasteur en verre pour placer une petite goutte (~15 μL) de solution d’agarose sur la lame. Aplatissez rapidement la goutte d’agarose en plaçant une autre lamelle sur le dessus. Laissez l’agarose se solidifier, puis retirez l’une des lamelles.
- Laissez sécher la lamelle recouverte d’agarose face vers le haut sur une table. Après 24 h, conservez les tampons d’agarose dans un récipient propre et sec.
REMARQUE : Ceux-ci peuvent être utilisés indéfiniment.
2. Tirez les aiguilles de micro-injection : à l’aide de capillaires en verre borosilicaté avec des filaments (diamètre extérieur 1,0 mm et diamètre intérieur 0,58 mm), tirez les aiguilles en vous basant sur Mello and Fire57 et d’autres ressources. Les aiguilles peuvent être utilisées immédiatement ou peuvent être stockées dans un récipient propre et sec, soutenu par des supports en argile.
3. Pour l’entretien des vers, préparez une gélose NGM versée dans des plaques de Petri et repérée avec la bactérie OP50 (pour les protocoles sur l’entretien standard de C. elegans et les recettes pour les milieux de croissance, voir Stiernagle).
4. Stadification des vers pour la micro-injection : 12 à 24 h avant la microinjection, prélever les hermaphrodites en L4 sur une nouvelle plaque de gélose NG avec des bactéries OP50 et les incuber pendant la nuit à 20 °C. Pour chaque mélange cible/injection Cas9, choisissez ~30 vers dans la plaque.
- Jour de la micro-injection : Chargez l’aiguille de micro-injection tirée avec le surnageant de solution RNP préparé à l’étape 1.2.
- Pipeter le surnageant de l’étape 1.2.4 dans une pipette capillaire tirée et remplir la solution de la pipette capillaire dans l’aiguille de micro-injection préparée (en chargeant généralement moins de 0,1 μL).
- Montez l’aiguille chargée sur l’appareil de micro-injection fixé à un micromanipulateur. Réglez la pression de l’appareil d’injection sur 250 kPa et la pression d’équilibre sur 25 kPa.
- Cassez la pointe de l’aiguille chargée pour générer un bord d’aiguille tranchant. Placez une lamelle carrée de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm sur le dessus d’une lamelle de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Recouvrir un bord de la lamelle carrée avec de l’huile d’halocarbure 700.
- Positionnez l’aiguille dans l’huile, au bord de la lamelle carrée de 15 mm.
- À l’aide d’une main pour guider la platine du microscope et la lamelle, brossez la lame vers le haut et le long du bord de l’aiguille tout en appuyant sur la pédale/le bouton d’injection. Cassez la pointe de l’aiguille, en augmentant le débit du liquide hors de l’aiguille. Obtenez un débit optimal en faisant remonter le mélange d’injection le long du bord de l’aiguille, formant ~1 bulle/s.
- Confirmer que les vers L4 cueillis 12 à 24 h avant la micro-injection sont de jeunes adultes à un stade de développement le jour de l’injection. Placez les jeunes vers adultes sur une plaque de gélose NG dépourvue de bactéries OP50 et laissez-les ramper pendant 5 min. Cela réduit la quantité de bactéries transférées vers le tampon d’injection, minimisant ainsi les obstructions de l’aiguille.
- Placez un tampon d’injection d’agarose/lamelle sur un endoscope de dissection. À l’aide d’un cure-fin, posez une petite trace d’huile d’halocarbure le long d’un bord du tampon.
- À l’aide du pic à vis sans fin enrobé d’huile, soulevez plusieurs vers de la plaque de gélose NG et dans la piste d’huile. À l’aide d’un poil fin attaché à une pipette, comme un cil ou une moustache de chat, positionnez les vers en parallèle, en poussant doucement les vers dans le tampon d’agarose. Jusqu’à ce que vous soyez à l’aise avec la procédure de micro-injection, ne montez et n’injectez qu’un seul ver à la fois.
NOTE : L’agarose sèche évacue l’humidité des vers, les faisant adhérer au coussinet. Par conséquent, il faut travailler rapidement car les vers peuvent se dessécher.
- Une fois en position et fixé au tampon, recouvrez les vers de quelques gouttes supplémentaires d’huile d’halocarbure (~20 μL) à partir de l’extrémité du cure-fin.
- C. elegans Micro-injection de gonades avec RNP et soins post-injection
Le protocole de micro-injection est adapté de Mello et Fire et décrit en détail ailleurs.
- Placez la lamelle avec les vis sans fin montées sur le microscope à injection. Sous un faible grossissement (objectif 5X, oculaire 10X), positionnez les vers perpendiculairement à l’aiguille d’injection.
- Passez à un grossissement élevé (objectif 40X, oculaire 10X), repositionnez l’aiguille adjacente au bras gonadique correspondant à la région proche des noyaux chez le pachytène moyen à tardif.
- À l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille contre le ver, en enfonçant légèrement la cuticule. Ensuite, d’une main, tapotez le côté de la platine du microscope pour faire passer l’aiguille à travers la cuticule. Appuyez sur la pédale/le bouton d’injection et remplissez lentement le bras de la gonade avec le mélange d’injection et retirez l’aiguille.
- Répétez cette étape avec l’autre bras gonadique.
- Une fois les vers injectés, retirez le tampon de lamelle/agarose et placez-le sous un microscope à dissection.
- À l’aide d’une pipette capillaire tirée, déplacez l’huile des vers en pipetant un tampon M9 sur eux. Effectuez ce traitement pour libérer les vers de l’agar.
- Au bout de 10 minutes, lorsque les vers se débattent dans le tampon, déplacez-les vers vers une plaque de gélose NG contenant des bactéries OP50 à l’aide de la pipette capillaire tirée. Placez la plaque à 20 °C pendant 2-3 h jusqu’à ce que les vers aient récupéré et se déplacent.
- Une fois récupérés, transférez individuellement les vers dans des plaques de gélose NG avec OP50 et transférez les plaques dans un incubateur à 25 °C.
- Laissez les vers injectés en P 0 se développer et pondre pendant 3 jours. Criblez la progéniture F 1.
- Si vous utilisez le co-CRISPR ou la co-conversion, sélectionnez les vers candidats au dépistage en fonction de leur présence du phénotype mutant du gène de référence. Transférez individuellement ces vers marqués sur de nouvelles plaques de gélose NG avec OP50 et laissez-les pondre une descendanceF2 à 20 °C.
REMARQUE : Le phénotype utilisé pour un criblage ou une sélection co-CRISPR doit fournir une estimation précoce du succès de l’édition de Cas9.
- Si le phénotype co-CRISPR n’est pas présent, micro-injectez un plasmide de contrôle positif pour aider à améliorer l’efficacité de la micro-injection.
REMARQUE : Par exemple, l’inclusion d’un plasmide dans le mélange d’injection qui code pour MYO-2 marqué mCherry aidera à évaluer l’efficacité de l’injection. Les vers injectés avec succès avec pCFJ90 auront une progéniture avec des pharynx fluorescents.
- Examinez les vers F1 pour vérifier la présence des modifications souhaitées. Prélevez la mère F1 dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits, lysez-la et examinez son ADN par amplification PCR spécifique à l’insert, analyse de séquence d’ADN ou test de nucléase (CEL-1).
REMARQUE : Ces tests peuvent être effectués lors de l’utilisation d’un co-CRISPR/co-conversion ou d’autres régimes de dépistage ou de sélection.
