Irradiation UV : une méthode pour intégrer des réseaux extrachromosomiques

Résumé

Source : Mariol, M. C et al. Un protocole rapide pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

La micro-injection de transgènes aboutit généralement à des souches de C. elegans avec de grandes puces extrachromosomiques, ce qui entraîne une expression et une transmission variables du transgène. L’irradiation UV peut induire une intégration chromosomique de la puce et une transmission plus stable des transgènes.

Protocole

Ce protocole est un extrait de Mariol et al, Un protocole rapide pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques à taux de transmission élevé dans le génome de C. elegans, J. Vis. Exp.(2013).

1. Irradiation UV et récupération des vers transgéniques

1. Irradiation par ver :
   1. Prélever 30 à 100 animaux transgéniques fluorescents L4 sur des plaques de culture séparées (15 à 20 animaux par plaque).
   2. Placez les plaques, avec les couvercles retirés, dans un réticulant UV. Irradier les vers à 0,012 J/cm². Notez que les souches sont plus ou moins sensibles aux UV et que les résultats peuvent être variables en fonction de l’irradiateur UV utilisé. Une gamme de doses comprise entre 0,010 et 0,015 J/cm² peut être testée.
2. Récupération du ver après irradiation :
   1. Placez les plaques avec les vers irradiés pendant la nuit à 15 °C pour la récupération.
   2. Vérifiez le nombre d’animaux vivants. Entre nos mains, un taux de survie d’environ 80 à 90 % est adapté pour une irradiation efficace.
   3. Faire pousser les animaux irradiés à 15-25 °C jusqu’à ce que la progéniture ait atteint le stade de développement, ce qui permet d’observer l’expression du marqueur de coinjection.

2. Isolement des lignées transgéniques intégrées

1. Sélection d’animaux F1 :
   1. Isoler 150 à 200 animaux fluorescents F1 sur des plaques de culture séparées. Pour les lignées à forte transmission (≥80 %), 100 animaux F1 suffisent.
   2. Maintenir ces plaques F1 à 15-25 °C jusqu’à ce que la progéniture atteigne un stade approprié pour l’observation des animaux F2 fluorescents.
   3. Jeter toutes les plaques F1 ne présentant soit i) aucune descendance, indiquant que l’animal F1 était stérile ou mort, soit ii) aucun ou seulement quelques animaux F2 fluorescents, indiquant que l’animal F1 n’a pas transmis le transgène au taux attendu. Cette étape est rapide et représente un réel avantage par rapport au protocole standard qui nécessite une estimation du pourcentage de vers F2 fluorescents afin de sélectionner des plaques F1 présentant une descendance ≥75 % fluorescente (Tableau 1).
2. Sélection des animaux F2 :
   1. Isoler quatre animaux fluorescents transgéniques F2 de chaque plaque F1 sélectionnée. Lorsque vous utilisez des transgènes fluorescents (par exemple mCherry, gfp ou dsRed), choisissez des vers F2 avec un niveau élevé de fluorescence car cela pourrait indiquer que ces animaux sont homozygotes pour le réseau intégré. Notez que lors de la cueillette d’animaux F2, il est essentiel de ne pas emporter d’œufs ou de larves, afin d’éviter les faux négatifs à l’étape suivante.
   2. Faites pousser des animaux F2 à 15-25 °C.
3. Isolement et validation de souches transgéniques intégrées :
   1. Plaques d’écran F2 pour vers F3 transgéniques 100 % fluorescents. L’écran est assez rapide car la présence d’un seul ver non fluorescent indique que la plaque doit être jetée. Un animal homozygote F2 pour le transgène intégré donnera une descendance fluorescente 100 % homozygote.
   2. Isoler huit animaux F3 fluorescents à partir de plaques sélectionnées pour confirmer l’hérédité à 100 % du transgène. En théorie, il suffit de choisir un seul animal à cette étape. Cependant, il peut être nécessaire de choisir huit animaux F3 fluorescents pour éviter de sélectionner des animaux non fertiles ou en mauvaise santé, car l’irradiation peut induire au hasard des mutations qui affectent des gènes importants pour la physiologie des vers.
   3. Si possible, conservez plusieurs souches transgéniques intégrées indépendantes, c’est-à-dire des souches récupérées sur différents animaux F1.

Résultats

Tableau 1. Comparaison des protocoles standard et améliorés pour l’intégration des puces extrachromosomiques dans le génome de C. elegans.Deux transgènes non intégrés émettant à peu près à la même fréquence ont été intégrés à l’aide de la norme ou du protocole amélioré. La principale différence réside dans le fait que dans le protocole standard, un dépista...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réticulateur U.V.	Fischer Scientific		Longueur d’onde 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Boîtes de Pétri, 60 mm	lmc	BPS55E6
Fil de platinium 0.25 mm	Alfa Aesar	04/06/7440	Pour faire une pioche pour les vers