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1. Génération de mammures primaires à partir de lignées cellulaires de cancer du sein humain
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile.
- Préparez un milieu de mammosphère contenant du DMEM/F12 complété par 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 100 U/ml de streptomycine. Préparez le milieu complet immédiatement avant l’utilisation en ajoutant 20 ng/ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF ; Sigma), 10 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes humains basiques recombinants (bFGF ; R&D Systems) et 1x supplément B27.
- Aspirez le milieu du flacon contenant des cellules adhérentes MCF-7 ou MDA-MB-231 (ou une lignée cellulaire de cancer du sein de votre choix ; 70-80 % de confluence), lavez deux fois dans 1x PBS et essayez les cellules.
- Centrifuger les cellules à 200 x g à température ambiante pendant 5 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 à 5 ml de milieu de mammographie. Pipeter de haut en bas et si nécessaire utiliser un filtre à filtre de 40 μm pour obtenir une suspension unicellulaire. Utilisez un hémocytomètre pour vous assurer qu’une suspension cellulaire unique s’est formée (sinon, utilisez une aiguille de 25 G pour seringuer la suspension cellulaire jusqu’à 3 fois).
- Si nécessaire, isolez le sous-ensemble cellulaire CD44+CD24- via FACS à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-CD24-phycoérythrine (PE) et anti-CD44-fluorescéine isothiocyanate (FITC)9. Vous pouvez également isoler cette population à l’aide d’un système de tri cellulaire activé par magnétisme (MACS) avec des microbilles combinées d’anti-CD44 et d’anti-CD24-biotine, conformément aux instructions du fabricant. Effectuez une sélection positive à l’aide de colonnes LS et une sélection négative à l’aide de colonnes LD et confirmez les phénotypes de toutes les cellules isolées par cytométrie en flux.
- Calculez le nombre de cellules viables par ml à l’aide de trypan blue.
note: La viabilité cellulaire est calculée en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules à l’intérieur des grilles de l’hémocytomètre. Les cellules qui absorbent le bleu de trypan sont considérées comme non viables. La procédure suivante est utilisée pour déterminer avec précision la proportion de cellules viables.
- Préparez une solution à 0,4 % de bleu de trypan dans du PBS. Ajouter 0,1 ml de solution mère de bleu de trypan pour 1 ml de cellules. Chargez un hémocytomètre et examinez immédiatement au microscope à faible grossissement. Comptez le nombre total de cellules et le nombre de cellules de coloration bleue. Cellules viables = [1,00 – (Nombre de cellules bleues ÷ Nombre de cellules totales)] × 100.
- Pour calculer le nombre de cellules viables par ml de culture, utilisez la formule ci-dessous. N’oubliez pas de corriger le facteur de dilution.
Nombre de cellules viables × 104 × 1,1 = cellules/ml de culture
- Remettre en suspension une quantité prédéterminée de cellules dans 2 ml de milieu mammosphérique complet dans chaque puits d’une plaque à 6 puits à très faible adhérence. La densité d’ensemencement est normalement de 500 à 4 000 cellules/cm2 cellules par puits. En option, utilisez des plaques à 24 puits à faible adhérence tout en enchaînant des cellules de même densité dans 0,5 ml de milieu.
note: Nous recommandons l’optimisation de la densité de semis et du moment de la culture pour chaque lignée cellulaire d’intérêt.
- Incuber des plaques à 6 puits à très faible adhérence à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 à 10 jours (en fonction de la lignée cellulaire et de la taille des mammozères) sans perturber les plaques, en particulier pendant la phase de croissance des 5 premiers jours.