1. Transduction des cellules tumorales dérivées de PDX
- Centrifuger les cellules tumorales dissociées à 300 g x 5 min et les remettre en suspension dans un milieu de mammosphère de 2 ml. Comptez les cellules viables à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan (Remettez en suspension les cellules digérées dans un tampon de lavage de 5 ml et comptez les cellules viables et non viables à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan. Brièvement, mélangez 50 μl de cellules et 50 μl de bleu de trypan et comptez le bleu de trypan en excluant les cellules à l’aide d’un hémocytomètre).
- Préparez 10 ml de milieu de mammosphère contenant 8 μg/ml de polybrène (2 μl de polybrène mère par ml de milieu).
- Déterminez le volume nécessaire pour 2 x 105 cellules tumorales viables. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min, et remettre les granulés en suspension dans 2 ml de milieu contenant du polybrène. Plaque 2 x 105 cellules tumorales viables par puits dans une plaque de culture tissulaire à très faible adhérence à 6 puits.
note: Il s’agit d’un nombre optimal de cellules nécessaires à la transduction avec un vecteur lentiviral.
prudence!Les particules lentivirales et tous les consommables utilisés avec des particules lentivirales doivent être manipulés conformément aux procédures institutionnelles relatives aux risques biologiques liés à l’ADN recombinant.
note: La transduction lentivirale des cellules mammaires primaires favorise fortement les cellules myoépithéliales, ce qui peut entraîner un mauvais marquage des cellules luminales et la sélection de sous-populations de cellules tumorales lors du marquage.
- Incuber le virus avec 200 mU/ml de neuraminidase à 37 °C pendant 1 heure avant la transduction afin d’augmenter la liaison des particules virales à différentes sous-populations de cellules primaires et de corriger ce biais potentiel.
- Ajouter des particules lentivirales à 10 MOI (2 x 106 TU pour 2 x 105 cellules viables) si les cellules dissociées de PDX sont appauvries en cellules de souris Lin+ ou enrichies en cellules EpCam+. Ajouter des particules lentivirales à 30 MOI (6 x 106 TU pour 2 x 105 cellules viables) si vous utilisez des cellules non enrichies dissociées de PDX.
note: L’augmentation du MOI permet une transduction efficace même en présence de grandes quantités de débris et de cellules mortes dans les extraits bruts. Gardez-en un puits avec des cellules non marquées pour servir de contrôle de la viabilité et de l’efficacité de la transduction.
- Tourbillonner pour mélanger le virus avec les cellules. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à 96 heures. Ajouter 500 μl de milieu mammosphérique frais 24 heures après la transfection. Les cellules ne se fixent pas aux plaques, n’aspirent pas les supports.
2. Évaluation de l’efficacité de la transduction et de la réimplantation de cellules marquées chez des souris immunodéprimées
- Surveiller l’expression du marqueur traçable (GFP) toutes les 24 heures à l’aide d’un microscope fluorescent à un grossissement de 10X.
note: L’expression de la GFP peut être observée dès 24 heures après l’infection, mais dans la plupart des PDX, l’expression de la GFP est clairement visible après 72 heures (Figure 1).
- Estimez l’efficacité de la transduction en évaluant le pourcentage de cellules GFP+ dans le puits total.
note: Étant donné que les cultures contiennent des cellules tumorales, des cellules stromales résiduelles et des cellules mortes à des degrés divers, des puits contenant aussi peu que 10 % de cellules GFP+ peuvent être implantés dans une souris hôte.
- Transférez les cellules transduites de plaques à 6 puits dans un tube conique de 15 ml. Ajoutez 1 ml de mammosphère dans le puits pour recueillir toutes les cellules restantes. Placer sur de la glace.
- Ajouter 10 ml de HBSS/hepes dans les cellules transduites et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant et le remettre en suspension dans 50 μl d’extrait de matrice bas-basale (BME) sur de la glace.
note: Les aliquotes BME doivent être décongelées sur de la glace 1 à 2 heures avant d’être utilisées. Le BME se solidifiera à température ambiante ; Restez sur la glace en tout temps.
- Chargez des cellules intégrées à BME dans une seringue à insuline de 0,5 ml, conservez-les sur de la glace et apportez-les à l’animalerie pour les réimplanter dans des souris NSG.
