Co-culture de cellules BC : Culture de cellules cancéreuses du sein avec des fragments d’os pour étudier la prolifération des cellules cancéreuses

1. Co-culture de cellules cancéreuses du sein adjacentes à des fragments d’os pour mesurer la prolifération des cellules mammaires à l’aide de BLI

1. Avant l’expérience, préparez une suspension contenant 2 x 10⁵ cellules cancéreuses du sein/50 μl, et préparez des bouchons de cire osseuse pour immobiliser les fragments osseux en culture. Coupez une pointe de micropipette P200 en 3 morceaux et utilisez l’extrémité étroite du plus grand morceau à l’emporte-pièce pour couper de petits morceaux (~35 mg) de cire d’os. Utilisez l’extrémité large du plus petit morceau pour éjecter les bouchons de cire d’os dans une boîte de Pétri pour le stockage.
2. Placez un morceau de cire d’os à la position 12 heures de chaque puits et appuyez doucement avec un index ganté de stérile.
3. Pipette de 50 μl de suspension cellulaire contenant 1 x 10⁵ cellules cancéreuses du sein dans DMEM-10 % FBS + Pen-Strep au centre de chaque puits d’une plaque à 6 puits. (Alternativement, ensemencez les cellules dans un motif dispersé si vous le souhaitez.) Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 45 min pour favoriser la fixation des cellules.
4. Placez 1 fragment d’os sur 1 morceau de cire d’os pour chaque puits expérimental et appliquez une légère pression avec le rongeur pour le fixer. Effectuez des expériences en trois exemplaires de sorte que 3 fragments d’os d’un spécimen THR donné soient placés dans les trois puits supérieurs, tandis que les trois puits inférieurs ne contiennent de la cire osseuse que comme témoins.
5. À l’aide d’une pipette de 5 ml, administrer doucement et lentement 5 ml de DMEM-10 % FBS sur le côté de chaque puits pour éviter de déloger les cellules mammaires ou les fragments osseux. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 20 à 24 heures.
6. Pour effectuer une imagerie par bioluminescence (BLI), retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez un substrat de luciférine (pour atteindre une concentration de 300 μg/ml) dans chaque puits. Imagez immédiatement la plaque sur une plate-forme d’imagerie IVIS en utilisant les paramètres suivants : diaphragme de 1, petit binning, temps d’exposition de 1 seconde, niveau D. Mesurez l’intensité du signal de chaque puits ainsi que la luminance moyenne (photons/seconde/centimètre carré/stéradian).
7. Utilisez un logiciel d’imagerie pour définir des régions d’intérêt (ROI) afin de quantifier la radiance moyenne de tous les puits d’expérimentation et de contrôle. Exportez les valeurs moyennes de luminance vers une feuille Excel pour effectuer des statistiques et générer des graphiques.