Milieu conditionné pour organes : Génération d’un milieu à partir de cellules d’organes récoltées pour des études sur le cancer métastatique

Résumé

Source : Piaseczny, M. M., et al. Génération de milieux conditionnés par les organes et applications pour l’étude des influences spécifiques aux organes sur le comportement métastatique du cancer du sein. J. Vis. Exp.(2016).

Cette vidéo décrit une méthode de génération d’un milieu conditionné par un organe dérivé du foie de souris. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et étudier les facteurs solubles dérivés d’organes et leurs effets sur le tropisme des organes et le comportement métastatique des cellules cancéreuses.

Protocole

1. Génération de milieux conditionnés par les poumons et le cerveau

1. Dans une cagoule de culture de tissus stérile, inversez trois fois les tubes PBS contenant le poumon ou le cerveau pour éliminer le sang résiduel des organes et aspirez le sang contenant du PBS. Répétez l’opération avec du PBS frais et froid jusqu’à ce que la solution apparaisse claire sans trace de sang.
2. Placez les poumons et le cerveau dans des boîtes de Pétri en verre séparées de 60 mm2. À l’aide de deux lames de scalpel stériles, hachez les poumons ou le cerveau en coupant à plusieurs reprises d’avant en arrière jusqu’à ce que les fragments de tissu aient une taille d’environ ~ 1 mm3.
3. Déterminez la quantité de milieu nécessaire pour remettre en suspension les fragments de tissu à partir de la différence de poids calculée.
   note: Le poids des tissus pulmonaires et cérébraux est normalisé par remise en suspension dans un rapport média :tissu de 4:1 (vol/poids).
4. Remettre en suspension des fragments de tissu dans un volume approprié (déterminé précédemment à l'étape 1.3) du milieu modifié de Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) : F12 complété par 1 supplément de mitogène concentré et de pénicilline (50 μg/ml)/streptomycine (50 μg/ml).
5. Ajoutez des fragments de tissu pulmonaire ou cérébral remis en suspension dans un puits d’une plaque à 6 puits.
6. Incuber des fragments de tissu dans un milieu pendant 24 heures à 37 °C et 5 % de CO2. Après l’incubation, prélever des milieux conditionnés pour chaque tissu et diluer davantage en ajoutant trois volumes équivalents de milieux frais dans un tube conique de 50 ml.
7. Centrifuger à 1 000 x g dans un milieu conditionné dilué pour chaque organe à 4 °C pendant 15 min pour éliminer les gros débris tissulaires. Prélever le surnageant du milieu et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
8. Mettez en commun les milieux conditionnés de chaque organe (c.-à-d. poumon avec poumon et cerveau avec cerveau) de plusieurs souris pour tenir compte de la variabilité d’une souris à l’autre. Aliquote et conserver le milieu conditionné à -80 °C jusqu’à utilisation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x solution saline tamponnée au phosphate	ThermoFisher Scientific	Référence 10010-023	Conserver stérile
Boîtes de Pétri en verre de 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Conserver stérile
DMEM : F12	Technologies de la vie	Référence 21331-020	Réchauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation, conserver stérile
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ml)	Technologies de la vie	Référence 15140-122	Conserver stérile
Tubes coniques de 50 ml	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Conserver stérile
Filtres à seringue de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	Z359904	Conserver stérile
Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Conserver stérile
Lames de scalpel	Fisher Scientific	S95937A	Conserver stérile