Gonflage de l’encre de Chine : une méthode de coloration pour visualiser les nodules tumoraux

Résumé

Source : Paschall, A. V. et al. Un modèle murin orthotopique de métastases spontanées du cancer du sein. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit le gonflage de l’encre de Chine, une méthode de coloration, pour quantifier les nodules tumoraux dans les poumons de souris porteuses de tumeurs. Après la coloration, les poumons sont fixés dans la solution de Fekete pour observer les nodules tumoraux dans les poumons.

Protocole

1. Validation des métastases pulmonaires à l’aide du gonflage à l’encre de Chine de poumons porteurs de tumeurs

REMARQUE : Pour valider les résultats de l’imagerie tumorale vivante à la luciférase, effectuez un gonflage à l’encre de Chine de poumons de souris porteuses de tumeurs pour quantifier les nodules tumoraux. Les cellules 4T1 métastasent également dans d’autres organes et tissus (Figure 1) et, par conséquent, un examen histologique de ces organes pour valider les métastases tumorales doit être effectué si nécessaire. Ce protocole utilise les métastases pulmonaires comme exemple.

1. Gardez les souris dans leur cage domestique existante pour l’euthanasie. Lorsqu’ils sont logés avec d’autres animaux, déplacez les souris qui ne sont pas euthanasiées dans une autre cage.
2. Retirez le dessus du filtre à cage et remplacez-le par le dessus du filtre CO2. Allumez la bouteille de gaz CO2 comprimé (100 %) qui est connectée au dessus du filtre à CO2. Réglez le débit à 2 L/min et maintenez le CO2 allumé pendant au moins 10 min. Si les souris respirent encore au bout de 10 minutes, laissez le CO2 allumé jusqu’à au moins 1 minute après que les souris ont cessé de respirer. Désactivez la commande de la bouteille de CO2 et le débitmètre. Attendez 3 minutes de plus et retirez le dessus du filtre.
3. Placez la souris sacrifiée sur son dos sur une planche de polystyrène. Épinglez les jambes pour assurer un accès libre à la trachée. Vaporisez les souris avec de l’éthanol à 70 %.
4. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez le long de la ligne médiane du milieu de l’abdomen de la souris à travers la cage thoracique et vers les glandes salivaires. Observez la trachée. Utilisez une pince pour enlever les tissus entourant la trachée afin d’exposer la trachée.
5. Enfilez une pointe de pipette sous la trachée. En tenant l’extrémité d’une main, soulevez doucement la trachée vers le haut et loin du corps.
6. Faites pivoter la plate-forme qui maintient la souris à 180°. À l’aide d’une seringue à tuberculine 1/2 CC 27 G 1/2, injectez de l’encre de Chine (10 % d’encre de Chine et 0,1 % d’hydroxyde d’ammonium) dans les poumons par la trachée. Gonflez complètement les poumons avec de l’encre jusqu’à ce qu’une forte résistance se fasse sentir.
7. Utilisez une paire de ciseaux pour couper la trachée. Utilisez des pinces pour tenir la souris et insérez un autre ensemble de pinces sous les poumons et retirez les lobes pulmonaires de la souris. Rincez brièvement les poumons dans un bécher contenant de l’eau.
8. Dans une hotte chimique, transférez les poumons dans un flacon à scintillation en verre contenant 3 ml de solution de Fekete (50 % d'éthanol, 6 % de formaldéhyde et 3 % d'acide acétique glacial). Boucher le flacon pour éviter que la solution ne s’évapore.
   note: Les tissus peuvent être stockés indéfiniment dans la solution de Fekete.
9. Après quelques minutes, observez les nodules tumoraux sous forme de points blancs sur les poumons noirs (Figure 1). Le nodule tumoral blanc est visible à l’œil nu. Transférez les poumons dans un plat dans une hotte et comptez le nombre de taches blanches. Chaque point blanc représente un seul nodule tumoral métastatique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Applicateur AutoClip 9 mm	Diagnostic des soins primaires Becton Dickinson. Sparks, MD	Référence 427630
Ciseaux de dissection pointus	pêcheur	Référence 8940
pinces à pointes fines	pêcheur	Référence 8875
70 % d’éthanol	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 seringue à tuberculine	Becton Dickinson et Cie, NJ	Référence 305620

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