1. Préparation de l’homogénat de tissu
- Les tissus réséqués (tissus malins et normaux réséqués de la salle d’opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel formé pour un prélèvement immédiat. Les fragments de tumeur, de NANT (pris à la distance la plus éloignée possible de la tumeur) et de tissus normaux sont systématiquement traités dans les 1 à 3 heures suivant l’exérèse chirurgicale dans un laboratoire BSL2 en utilisant des procédures de biosécurité standard pour les tissus humains. Un organigramme du protocole est illustré à la figure 1.
- Pesez tous les fragments de tissu (normal, NANT et tumoral) et mesurez la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Il s’agit d’une étape importante pour la normalisation ultérieure des sous-populations cellulaires, de l’ARN extrait, etc.
note: La taille de l’échantillon est comprise entre 100 et 10 000mm3, sans graisse si possible.
- Imprimez le fragment de tumeur sur une lame de verre pour la coloration H&E afin de vérifier que le tissu fait réellement partie de la tumeur.
- Pour ce faire, appuyez sur une lame de microscope en verre sur le fragment de tumeur et appliquez une légère pression avec vos doigts pendant quelques secondes.
- Fixez la lame avec de l’isopropanol pendant 2 min, suivie d’une étape de lavage à l’eau. Contre-colorez le tissu pendant 30 secondes avec de l'hématoxyline de Mayer.
- Lavez le toboggan dans six bains d’eau. Colorer la phloxine B à 2 % pendant 15 sec.
- Laver dans un bain d’eau suivi de quatre bains d’isopropanol et terminer par un bain d’eau.
- Incuber dans de l’isopropanol pendant 1 min et égoutter. Clair en deux bains de xylène.
- Montage avec support de montage à base de xylène. Examinez la cellularité tumorale (Figure 2).
note: Principalement, les cellules tumorales se collent à la lame imprimée - les cellules stromales, lymphoïdes ou adipeuses restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2).
- Placez le fragment de tissu dans une petite boîte de culture contenant 1 ml de milieu cellulaire hématopoïétique chimiquement défini et sans sérum (ci-après dénommé milieu) à température ambiante et coupez-le en petits morceaux (~1 - 2 mm2) à l’aide d’un scalpel stérile.
- Transférez le tout (fragments de tissu + milieu) dans un tube C dissociateur mécanique.
- Rincer la boîte de Pétri et le scalpel avec 2 ml de milieu à l’aide d’une pipette Pasteur et l’ajouter dans le tube C (volume de milieu pour la dissociation = 3 ml).
- Utilisez le programme de dissociation mécanique A.01 pour tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissu en une suspension unicellulaire. Placez le tube C dans l’appareil et exécutez le programme deux fois de suite (un cycle = 25 secondes).
note: Cette procédure d’homogénéisation a été établie et validée pour le tissu mammaire humain, d’autres tumeurs ou types de tissus peuvent nécessiter l’utilisation d’un programme différent et doivent être testés en premier.
- Retirer le tube C de l’appareil et transvaser l’homogénat directement dans une crépine à cellules de 40 μm posée sur un tube de 50 ml. À l’aide de la même pipette Pasteur qu’à l’étape 1.6, transférez le liquide restant dans le tube C dans la crépine de la cellule.
- Transférez le liquide filtré dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 ml. Conservez temporairement la passoire à cellules et son tube de 50 ml.
- Rincez le tube C avec 3 ml de fluide supplémentaire et transférez-le, à l’aide de la même pipette Pasteur qu’à l’étape 1.6, dans la passoire de cellule toujours posée sur le tube de 50 ml. Pressez une quantité maximale de liquide résiduel piégé dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en le déplaçant doucement autour de la crépine à l’aide d’une pipette Pasteur propre ou d’un embout de 1 ml qui est ensuite jeté pour éviter de contaminer l’éluat.
- Placez la passoire cellulaire à l’envers sur le tube C d’origine et rincez avec 3 ml de milieu de manière à ce que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C.
- Réhomogénéiser comme à l’étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01.
- Versez ce deuxième homogénat à travers la crépine cellulaire située sur le tube de 50 ml, rincez à nouveau le tube C avec un milieu de 3 ml (comme à l’étape 1.10) et transférez avec la pipette Pasteur dans la crépine de cellule située sur le tube de 50 ml en pressant à nouveau une quantité maximale de liquide du tissu conjonctif résiduel piégé dans la crépine cellulaire.
- À ce stade, un volume de ~2,5 ml se trouve dans le tube de 15 ml et de ~9 ml dans le tube de 50 ml.
2. Séparation du surnageant tissulaire et des cellules
- Centrifuger les homogénats dans les tubes de 15 ml et 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante.
- Décantez le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et conservez-le temporairement à 4 °C. Ce surnageant = tumeur primaire, NANT ou SN de tissu normal (volume final 2,5 ml) est ensuite clarifié et aliquote avant d’être stocké à -80 °C pour des analyses ultérieures (voir ci-dessous).
- Jetez le surnageant du tube de 50 ml.
- Remettez doucement en suspension les deux granules de cellules dans un volume final de 1 ml de milieu. Brièvement, cassez d’abord doucement la pastille cellulaire dans les deux tubes (en tapotant le tube sur une surface dure). Remettez en suspension la pastille à cellules libres dans le 50 ml avec 500 μl de milieu et transférez cette suspension cellulaire dans le tube de 15 ml pour remettre en suspension la deuxième pastille. Répétez cette étape une fois avec les 500 μl de milieu pour une récupération maximale des cellules.
- Transférez 10 μl de suspension cellulaire dans un petit tube, mélangez avec 10 μl de bleu trypan (dilution 1:1) et comptez le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre.
note: À ce stade, une fraction de la suspension cellulaire peut également être analysée par cytométrie en flux pour évaluer la taille de la cellule, la granularité et, si nécessaire, un nombre limité de marqueurs de sous-population pour une évaluation plus précise de la distribution cellulaire relative dans l’homogénat avant une analyse ou une expérimentation approfondie. Toutes les analyses par cytométrie en flux intègrent le marquage CD45 pour la normalisation des sous-populations.
- Granuler les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, du NANT ou du tissu normal sont maintenant prêtes pour une purification ou une analyse plus approfondie. Ces étapes supplémentaires sont meilleures lorsqu’elles sont effectuées le même jour que la chirurgie.
note: Pour l’analyse cytométrique en flux, mais pas pour le tri cellulaire, les globules rouges résiduels doivent être lysés après le marquage des anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse des globules rouges à la pastille cellulaire, en remuant immédiatement pendant 1 seconde et en incubant un minimum de 10 minutes à température ambiante (à l’abri de la lumière) avant l’analyse.
3. Clarification du surnageant tissulaire
- Centrifugez les tubes de 1,5 ml avec du tissu SN à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Retirez délicatement le surnageant sans toucher ni déranger la pastille. Transférer dans un tube propre (ou des tubes) en fonction du nombre et du volume d’aliquotes souhaités.
- Stockez le surnageant à -80 °C pour une utilisation future.
