1. Préparation de 3 % de 2-hydroxyéthyle agarose
- Dans un flacon en verre propre et sec de 100 ml, ajoutez 0,9 g d’agarose 2-hydroxyéthyle (Agarose VII) suivi de 30 ml d’eau distillée.
- Cuire le mélange au micro-ondes pendant 15 secondes et remuer doucement. Répétez cette étape au moins trois fois de plus jusqu’à ce que la poudre d’agarose se dissolve complètement.
- Autoclave le flacon contenant la solution pendant 15 min.
- Laissez la solution d’agarose refroidir à RT avant de l’utiliser ultérieurement. Stockez la solution chez RT.
2. Préparation de la couche inférieure : 0,6 % de gel d’agarose
- Préchauffez plusieurs pipettes de 5 ml et 10 ml dans un incubateur à 37 °C pour éviter que l’agarose ne se solidifie dans la pipette lors de la manipulation.
- Desserrez partiellement le couvercle de la bouteille et passez au micro-ondes la solution préfabriquée de 2-hydroxyéthyl agarose à 3 % pendant 15 secondes. Ensuite, agitez doucement la solution et passez au micro-ondes pendant 15 secondes supplémentaires
prudence: Soyez prudent lorsque vous faites tourner la solution d’agarose car la solution remonte lorsqu’elle est exposée à l’air et peut déborder.
- S’il y a du gel solide résiduel dans la bouteille, passez au micro-ondes pendant quelques secondes de plus.
- Conservez le flacon contenant la solution d’agarose dans un bain-marie à 45 °C pendant les étapes suivantes pour éviter que la solution d’agarose ne se solidifie prématurément.
- Milieu MCF10DCIS chaud dans un bain-marie à 37 °C.
note: MCF10DCIS milieu se compose de DMEM/F12, de 5 % de sérum de cheval, de 5 % de pénicilline et de streptomycine.
- Transférez 3 ml de la solution d’agarose à 3 % à l’aide des pipettes préchauffées dans un tube conique stérile de 50 ml.
- Ajouter immédiatement 12 ml de média MCF10DCIS chaud et retourner doucement le tube conique pour mélanger l’agarose avec le média. Essayez de ne pas former de bulles car cela interférerait avec le comptage de la colonie plus tard.
- Ajoutez délicatement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture à 6 puits sans former de bulles d’air.
- Incuber la plaque de culture à 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier.
- Une fois le mélange solidifié, placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. La couche inférieure est maintenant prête à l’emploi.
3. Préparation de la couche contenant des cellules : 0,3 % de gel d’agarose
- Trypsinisez MCF10DCIS cellules et diluez-les à une concentration cellulaire de 4 x 104 /ml.
- Prélever 2 ml d’agarose à 3 % à l’aide de pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique stérile de 50 ml.
- Ajouter immédiatement 8 ml de MCF10DCIS média dans le tube conique et retourner doucement pour mélanger l’agarose avec le média. Évitez de former des bulles.
- Prélever 2 ml des cellules MCF10DCIS (4 x 104 /ml) et traiter avec du BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
- Dans une dilution 1:1, mélangez les cellules avec l’agarose à 0,6 %.
- Prélever 1 ml du mélange cellule-agarose et l’ajouter délicatement sur la couche inférieure de la plaque de culture à 6 puits (2 x 104 cellules/ml).
- Placez la plaque de culture à 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant au moins 15 min pour permettre à la couche supérieure de se solidifier.
- Une fois que le mélange s’est solidifié, placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant une semaine avant d’ajouter la couche d’alimentation.
4. Préparation de la couche nourricière : 0,3 % de gel d’agarose
- Passez au micro-ondes la solution préfabriquée de 2-hydroxyéthyle agarose à 3 % pendant 15 secondes, agitez doucement la solution et passez au micro-ondes pendant 15 secondes supplémentaires.
- Équilibrez le flacon de solution d’agarose dans un bain-marie à 45 °C.
- Réchauffez le média MCF10DCIS dans un bain-marie à 37 °C.
- Mélangez 1 ml de solution d’agarose à 3 % avec 9 ml de milieu MCF10DCIS chaud dans un tube conique de 50 ml et retournez doucement pour mélanger l’agarose avec le milieu. Évitez de former des bulles d’air.
- Traitez le mélange avec du BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
- Ajoutez délicatement 1 ml de ce mélange (sans former de bulles) dans chaque puits de la plaque de culture à 6 puits contenant le fond et les couches molles.
- Placez la plaque de culture à 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant au moins 15 min pour permettre au mélange de se solidifier.
- Une fois que la couche d’alimentation s’est solidifiée, placez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
- Répéter cette procédure d’alimentation chaque semaine en superposant 1 ml de solution d’agarose/milieu/traitement à 0,3 % sur la couche nourricière existante pour reconstituer les cellules avec de nouveaux milieux jusqu’à ce que la formation de colonies soit observée.
note: La gélose dans les couches molles et nourricières est très molle et, par conséquent, les nutriments ajoutés de la couche nourricière se diffuseront facilement dans la couche contenant les cellules pour atteindre les cellules.