Gonflage de l’agarose pulmonaire entière : une méthode de préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo

Résumé

Source : Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment, J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo décrit une méthode de préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo afin d’étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales, en utilisant l’agarose pour l’inflation. Dans le protocole d’échantillonnage, la procédure de gonflage de l’agarose est décrite avant l’observation des interactions cellulaires en direct.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo

REMARQUE : Essayez de travailler aussi stérilement et soigneusement que possible pour éviter les défis inutiles des cellules immunitaires dans les poumons.

1. Injecter à la souris un surdosage létal d’un anesthésique autorisé par le protocole animal approuvé par l’IACUC, par exemple, 1 ml d’Avertin à 2,5 %. Attendez que la souris cesse de respirer et qu’elle ne réponde pas du tout aux stimuli nocifs (pincement de la patte arrière).
   REMARQUE : La luxation cervicale et l’euthanasie au dioxyde de carbone doivent être évitées car elles peuvent nuire à la viabilité des cellules pulmonaires.
2. Immobilisez la souris sur une planche de dissection et stérilisez-la avec de l’éthanol à 70 %.
3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire d’abord une incision épigastrique transversale à travers la peau, suivie d’une incision similaire à travers le péritoine. Tenez la planche de dissection en position verticale et coupez l’aorte descendante, de sorte que le sang s’accumule dans l’abdomen et non dans la cavité thoracique.
4. Coupez une petite ouverture dans le diaphragme pour libérer le vide. Coupez le long des 10e et 12e côtes pour exciser le diaphragme et obtenir un accès visuel aux poumons.
5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau jusqu’à la trachée au-dessus de la cage thoracique, mais laissez la cage thoracique intacte. Séparez la peau de la cage thoracique. Explichez la trachée en enlevant le tissu conjonctif environnant, en faisant attention de ne pas endommager la trachée elle-même (Figure 1A).
6. Coupez une petite ouverture d’environ 1 mm de diamètre dans la trachée exposée, parallèlement aux anneaux cartilagineux, le plus près possible du larynx (figure 1B). Veillez à ne pas couper complètement la trachée.
7. Prenez une aiguille de 20 G et insérez-la doucement à 4-5 mm dans la trachée sans aucune contre-force (Figure 1D). L’extrémité de l’aiguille doit être visible à travers la trachée (Figure 1C). Utilisez une pince pour stabiliser l’aiguille dans la trachée. Alternativement, une suture peut être attachée autour de la trachée pour maintenir l’aiguille en place.
   REMARQUE : En insérant trop profondément, la carène peut être traumatisée ou un seul côté des poumons peut être gonflé.
8. Remplissez une seringue de 400 μl d’agarose à basse température de fusion à 37 °C (prélevée directement d’un bain à température constante). Assurez-vous que la planche de dissection est debout et instillez lentement l’agarose chaude à travers l’aiguille dans les poumons, utilisez ~400 μl pour gonfler les poumons.
   REMARQUE : Regardez les poumons gonfler à l’intérieur de la cage thoracique. Ne gonflez pas trop le poumon car il se romprait.
9. Une fois que les poumons sont gonflés, remplissant ~2/3 de la cage thoracique, détachez la seringue et maintenez l’aiguille à l’intérieur de la trachée pour éviter toute fuite d’agarose.
10. Versez environ 50 ml de PBS à 20 °C sur les poumons gonflés pour permettre à l’agarose à l’intérieur des poumons de prendre et de se solidifier. Retirez lentement l’aiguille et fermez la trachée à l’aide d’une pince pour éviter que l’agarose non solidifiée ne fuie.
11. Exposez les poumons en effectuant une sternotomie et excisez ensuite les poumons. Pour l’excision des poumons, tenez la trachée tout en coupant complètement la trachée. Tirez doucement la trachée vers le haut, coupez le tissu conjonctif et l’œsophage tout en retirant les poumons de la cavité thoracique jusqu’à ce que les poumons soient séparés de la souris (Figure 1E).
12. Immergez les poumons dans du RPMI-1640 chaud pour éliminer l’excès de sang et séparez doucement les lobes à l’aide de ciseaux et de pinces pour couper la bronche de la tige principale des lobes au niveau du hile (Figure 1F).
13. Placez les lobes, avec la surface plane vers le bas pour maximiser la surface d’imagerie, dans un puits d’une plaque d’imagerie à 24 puits (Figure 1G). Ajoutez 100 μl de RPMI-1640 à 37 °C sur le dessus des lobes. Placez plusieurs lames de couverture de microscope circulaire de 15 mm sur le dessus des lobes pour l’empêcher de flotter.
14. Versez du PBS chaud dans les puits environnants pour éviter que le média RPMI-1640 ne s’évapore. Insérez la plaque à 24 puits dans la chambre climatique équilibrée et maintenez les lobes pulmonaires à 37 °C avec de l’air et 5 % de CO₂. Insérez la chambre climatique sur la platine du microscope confocal.
    REMARQUE : D’autres mélanges gazeux (p. ex., 5 % de O₂, 5 % de CO₂ dans le N₂ pour examiner le comportement cellulaire dans des conditions d’hypoxie ou de faible teneur en oxygène) pourraient également être envisagés.

Résultats

Graphique 1. Protocole de préparation des poumons pour l’imagerie en direct.(A) Exposition de la trachée après la préparation de la souris. (B) Petite coupure faite dans la trachée exposée parallèlement aux anneaux cartilagineux. (C) Aiguille de 20 g insérée à 4-5 mm dans la trachée. (D) Instillation de 400 μ

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anesthésique	Na	Na	Anesthésie approuvée par l’IACUC, utilisée pour l’anesthésie et/ou l’euthanésie
PBS, USP stérile	Amresco INC	K813-500ML	Grade ultra pur pour injection intraveineuse
1 fois le PBS	Installation de culture cellulaire de l’UCSF	Na
Plate-forme en polystyrène	Na	Na	Sera utilisé comme planche de dissection
Ciseaux fins tranchants	Outils scientifiques fins	Référence 14060-11
20 G x 1 aiguille, biseau court	Bd	305178
forceps	Magasin de chirurgie Roboz	RS-5135
Seringue de 1 mL sans aiguille	Bd	309659
Agarose à basse température de fusion	Lonza	Référence 50111	Pour faire 10 ml de solution, peser 0,2 g d’agarose, ajouter à 10 ml 1 x PBS et chauffer pour dissoudre. L’agarose se solidifie à température ambiante, alors conservez-la dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour le gonflage.
Milieu RPMI-1640 sans rouge de phénol	Technologies de la vie	Référence 11835-030
Plaque d’imagerie 24 puits	E&K scientifique	EK-42892
Glissières de protection en verre, 15 mm	Fisher Scientific	Référence : 22-031-144
Régulateur numérique de CO2 et de température	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Chambre climatique	Okolab	Na	http://www.oko-lab.com
Microscope confocal à disque rotatif Cell Observer	Zeiss	Na
air	Ucsf	Na
oxygène	Ucsf	Na
dioxyde de carbone	Ucsf	Na