1. Passage et culture de cellules TUM622 dans des cultures 2D
- Milieu de culture 3D chaud et réactifs de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux) pour les cellules TUM622 à 37 °C.
- Passage des cellules TUM622 à 80 % de confluence dans des flacons 2D. Habituellement, cela se produit 1 semaine après le décès.
- Jeter l’ancien milieu d’une fiole T75 et laver une fois avec 6 mL de tampon HEPES. Évitez de pipeter directement sur les cellules.
- Aspirez le tampon HEPES. Ajouter 4 mL de trypsine/EDTA (0,25 mg/mL, voir le tableau des matériaux) pour un rinçage rapide et jeter la trypsine/EDTA.
- Ajouter 2 mL de trypsine/EDTA et incuber à 37 °C pendant 5 min. Retirer les flacons de l’incubateur et tapoter les flacons pour détacher les cellules sans créer de bulles d’air et remettre les flacons dans l’incubateur pendant 5 min supplémentaires><.
note: Une exposition prolongée à la trypsine endommagera irréversiblement les cellules et modifiera leur phénotype, il est donc recommandé de limiter le temps d’exposition des cellules à la trypsine.
- Confirmez que les cellules se sont détachées et dissociées au microscope optique (4x ou 10x). Ajouter 4 mL de tampon de neutralisation (tampon TNS) (voir les informations sur les réactifs de sous-culture dans la Table des matières) suivis de 10 mL de milieu de culture 3D (voir la Table des matières).
- Pipette de haut en bas doucement pour dissocier davantage les cellules à l’aide d’une pipette de 10 ml. Transvaser la suspension à travers une crépine de 40 μm dans un tube conique de 50 mL.
- Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
- Ensemencer 0,8 x 10 fiole de6 cellules/T75 dans 20 mL de milieu de culture 3D (voir le tableau des matériaux).
- Nourrissez les cellules tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu épuisé par du milieu frais.
2. Placage des cellules TUM622 dans la matrice extracellulaire pour la culture 3D
- La veille de l’expérience, décongelez pendant la nuit des flacons de matrice à membrane basale dans un réfrigérateur à 4 °C. Refroidissement des pipettes en plastique (2 mL) et des pointes à -20 °C pendant la nuit.
note: Tous les lots de matrice de membrane basale n’ont pas la même capacité à supporter la croissance 3D des cellules TUM622. Par conséquent, il est nécessaire d’acquérir et de tester plusieurs lots de matrice de membrane basale pour identifier ceux qui soutiennent la formation d’acini robustes. Habituellement, cela nécessite une concentration plus élevée de protéines (16-18 mg/mL) dans la matrice.
- Le jour de l’expérience, un milieu de culture 3D chaud, un tampon HEPES, de la trypsine/EDTA et un tampon de neutralisation de la trypsine (TNS) dans un bain-marie à 37 °C. Immédiatement avant de mettre en place la culture, sortez la matrice de membrane basale décongelée du réfrigérateur et mettez le flacon sur de la glace.
- Refroidissez les plaques de culture tissulaire sur une glacière à plate-forme métallique posée sur de la glace. Placez les tubes à centrifuger sur une grille de refroidissement en métal sur de la glace.
- À l’aide des cellules TUM622 obtenues à l’étape 1.7, calculez le nombre souhaité de cellules nécessaires pour le placage. En règle générale, 15 000 à 30 0000 cellules sont nécessaires par puits d’une plaque de 24 puits. Une densité plus faible est plus adaptée à l’imagerie et à la quantification, tandis qu’une densité plus élevée est préférée lors de la collecte de cellules pour l’extraction d’ARN ou le western blot.
- Transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation refroidi (chaque tube contenant des cellules pour le placage triple) et essorez-la à 300 x g dans une centrifugeuse à godets suspendus à 4 °C pendant 5 min.
- Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette aspirante fixée à une pointe non filtrée (20 μL), en laissant environ 100 μL du fluide dans le tube (utilisez des marques sur le tube comme guide).
- Tapotez doucement sur le côté du tube pour déloger et dissocier la pastille avant de la remettre sur la grille de refroidissement.
- À l’aide des pipettes prérefroidies de 2 ml, mélangez délicatement la matrice en pipetant de haut en bas à quelques reprises tout en gardant le flacon en contact avec la glace. Pipetez à une vitesse régulière et modérée afin qu’aucune bulle ne soit introduite dans la matrice pendant cette procédure.
- Transférez le volume approprié de la matrice dans chaque tube à centrifuger. Pour plaquer les triplets dans une plaque à 24 puits, ajoutez 1,1 mL de matrice de membrane basale dans chaque tube.
- À l’aide d’embouts pré-refroidis, pipetez la matrice de chaque tube de haut en bas environ 10 fois pour obtenir une suspension cellulaire uniforme.
- Transférez 310 μL de suspension de cellule/matrice dans chaque puits d’une plaque pré-refroidie à 24 puits. La pipette est placée à un angle de 90° par rapport à la surface de la plaque et la suspension est ajoutée au centre du puits. La suspension doit s’étendre et couvrir tout le puits sans avoir besoin d’incliner la plaque.
- Pour faciliter l’analyse par immunofluorescence en aval, plaquez la suspension cellule/matrice en parallèle dans des lames de chambre à 2 puits. Transférez 100 μL de suspension de cellule/matrice au centre d’un puits ou d’une lame de chambre à 2 puits (voir le tableau des matériaux). Cela permet à la matrice de former une structure en forme de dôme avec un volume beaucoup plus petit.
- Remettez la plaque et la chambre dans un incubateur de culture tissulaire et incubez pendant 30 minutes pour permettre à la matrice de se solidifier. Examinez la plaque/lame au microscope optique pour vous assurer que les cellules individuelles sont uniformément réparties dans la matrice (4x ou 10x).
- Ajoutez 1 mL de milieu de culture 3D complet préchauffé dans chaque puits et 1,5 mL de milieu de culture 3D dans chaque puits de la lame de chambre, puis remettez-les dans l’incubateur.
