Dosage de l’extraction d’ARN : une méthode pour extraire de l’ARN de cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN

Résumé

Source : Hossian, A. K. M. N. et al., Analyse des traitements combinatoires de miARN pour réguler le cycle cellulaire et l’angiogenèse. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le protocole d’extraction d’ARN à partir de cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN. Cette approche peut être utilisée pour identifier une activité de traitement combinatoire des miARN dans l’arrêt du cycle cellulaire et l’angiogenèse.

Protocole

1. Transfection miR-143 et miR-506

ATTENTION : Utilisez des gants en latex, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire lors de la réalisation des expériences décrites. Si nécessaire, utilisez l’enceinte de biosécurité avec le ventilateur de l’armoire allumé, sans bloquer les voies respiratoires ni perturber le flux d’air laminaire. Réglez toujours la fenêtre de protection en verre à la hauteur appropriée, comme décrit par le fabricant.

1. Implantez des cellules de CPNPC A549 dans une fiole de^{25 cm 2}/plaque à 6/96 puits dans un milieu DMEM/F12K complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (milieu de culture) dans une hotte de culture tissulaire et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture tissulaire.
2. Mettre en suspension les miR-143 et/ou miR-506, ou brouiller les siARN avec un agent transfecteur (2,4 μg de miR ont été mélangés à 14 μL d’agent transfecteur ; voir le tableau des matériaux) dans 500 μL de milieu de transfection et 1,5 mL de sérum et de milieu DMEM/F12K sans antibiotique à une concentration finale de miARN de 100 nM. La quantité de miARN peut nécessiter une optimisation sur différentes cellules et concentrations. Les approches appropriées comprennent la transfection de cellules avec des concentrations croissantes de miARN (c’est-à-dire 50-200 nM) et l’évaluation de la régulation négative de l’expression des gènes d’intérêt.
3. Retirer le milieu de culture du ballon/de la plaque et laver une fois avec 1x PBS.
4. Ajouter les complexes miARN/agent de transfectation et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 6 h (la taille du ballon définit le volume d’incubation ajouté).
5. Remplacer le milieu par 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pendant 24 h et/ou 48 h.
6. Récoltez les cellules transfectées par trypsinisation, en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA dans chaque fiole T25 cm², incubez pendant 5 à 10 min à 37 °C et ajoutez 3 mL de milieu de culture pour récolter les cellules. Placer le contenu de chaque fiole dans un tube séparé de 15 mL marqué. Travailler dans une hotte de culture tissulaire.
7. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
   note: La prudence est de mise lors de l’élimination du surnageant, car l’agitation du tube peut entraîner une perte de cellules.
8. Ajouter 2 mL de 1x PBS et centrifuger pendant 5 min à 751 x g.
9. Répétez une fois les étapes 7 et 8 pour éliminer toute trace de support et de surnageant.
   note: À ce stade, les tubes d’échantillon peuvent être stockés à -80 °C ou peuvent être utilisés immédiatement.

2. Extraction de l’ARN

1. Nettoyez la zone de travail en pulvérisant de l’alcool isopropylique à 70 % et une solution de décontamination à base d’ARNase.
2. L’extraction de l’ARN doit être effectuée à l’aide d’un kit d’ARN approprié (voir le tableau des matériaux).
3. Retirez les tubes à -80 °C et laissez-les décongeler. Ajoutez 300 μL de tampon de lyse et pipetez de haut en bas pour briser la membrane cellulaire.
4. Ajoutez un volume égal d’éthanol 100 % ultra-pur.
5. Bien mélanger et placer dans la colonne de séparation.
6. Centrifuger entre 11 et 16 x g pendant 30 s et retirer le passage d’écoulement.
7. Ajouter 400 μL de tampon de lavage et centrifuger pour retirer le tampon.
8. Ajouter 5 μL d’ADN I avec 75 μL de tampon de digestion d’ADN dans chaque échantillon et incuber pendant 15 min.
9. Lavez l’échantillon avec 400 μL de tampon de préparation d’ARN.
10. Laver 2 fois avec un tampon de lavage à ARN.
11. Ajoutez de l’eau sans nucléase dans la colonne, centrifugez, puis récupérez l’ARN.
12. Mesurez la concentration totale d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre UV.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A549 Cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules	ATCC	ATCC CCL-185
Silencieux Ambion Contrôle Négatif N°1 siRNA	Ambion	AM4611
has-miR-143-3p miRNA Mimic	Abm	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	Abm	MCH02824
Sérum fœtal bovin (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Solution saline tamponnée au phosphate HyClone (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L de glucose, sans pyruvate de sodium, avec L-glutamine	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure Eau distillée sans DNase/RNase	Invitrogen	Tél. : 10-977-015
Kits d’ARN rapide	Recherche Zymo	Réf. R1055
éthanol, absolu (200 proof), qualité biologie moléculaire,	Bioréactifs Fisher	BP2818500
-80 °C Congélateur	VWR	VWR40086A
Nanogoutte	Thermo Scientific	NanoDrop un C
Plaque à 96 puits	CELLTREAT Scientifique	Tél. : 50-607-511
Pénicilline-streptomycine 10/10	Produits biologiques Antlanta	Réf. B21210
Incubateur à CO2	Thermo Scientific	HERAcell 150i
DNASE	Recherche Zymo	E1010
Mélange de nutriments F-12K (Mod. de Kaighn) avec L-glutamine, Corning	Corning	Réf. 45000-354
Sérum fœtal bovin - Premium	Produits biologiques Antlanta	Réf. S11150
Centrifugeuse à température contrôlée matchine	Thermo Scientific	ST16R
Micro centrifugeuse matchine à température contrôlée	Eppendrof	5415R