1. Transfection miR-143 et miR-506
ATTENTION : Utilisez des gants en latex, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire lors de la réalisation des expériences décrites. Si nécessaire, utilisez l’enceinte de biosécurité avec le ventilateur de l’armoire allumé, sans bloquer les voies respiratoires ni perturber le flux d’air laminaire. Réglez toujours la fenêtre de protection en verre à la hauteur appropriée, comme décrit par le fabricant.
- Implantez des cellules de CPNPC A549 dans une fiole de25 cm 2/plaque à 6/96 puits dans un milieu DMEM/F12K complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (milieu de culture) dans une hotte de culture tissulaire et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture tissulaire.
- Mettre en suspension les miR-143 et/ou miR-506, ou brouiller les siARN avec un agent transfecteur (2,4 μg de miR ont été mélangés à 14 μL d’agent transfecteur ; voir le tableau des matériaux) dans 500 μL de milieu de transfection et 1,5 mL de sérum et de milieu DMEM/F12K sans antibiotique à une concentration finale de miARN de 100 nM. La quantité de miARN peut nécessiter une optimisation sur différentes cellules et concentrations. Les approches appropriées comprennent la transfection de cellules avec des concentrations croissantes de miARN (c’est-à-dire 50-200 nM) et l’évaluation de la régulation négative de l’expression des gènes d’intérêt.
- Retirer le milieu de culture du ballon/de la plaque et laver une fois avec 1x PBS.
- Ajouter les complexes miARN/agent de transfectation et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 h (la taille du ballon définit le volume d’incubation ajouté).
- Remplacer le milieu par 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pendant 24 h et/ou 48 h.
- Récoltez les cellules transfectées par trypsinisation, en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA dans chaque fiole T25 cm2, incubez pendant 5 à 10 min à 37 °C et ajoutez 3 mL de milieu de culture pour récolter les cellules. Placer le contenu de chaque fiole dans un tube séparé de 15 mL marqué. Travailler dans une hotte de culture tissulaire.
- Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
note: La prudence est de mise lors de l’élimination du surnageant, car l’agitation du tube peut entraîner une perte de cellules.
- Ajouter 2 mL de 1x PBS et centrifuger pendant 5 min à 751 x g.
- Répétez une fois les étapes 7 et 8 pour éliminer toute trace de support et de surnageant.
REMARQUE : À ce stade, les tubes d’échantillon peuvent être stockés à -80 °C ou peuvent être utilisés immédiatement.
2. Analyse du cycle cellulaire
- Ensemencer 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans une fiole de T25 cm2 et effectuer une transfection selon le protocole décrit à la section 1, étapes 1 à 5.
- Après 24 h et 48 h, récoltez ensuite les cellules par trypsinisation.
- Transférez les suspensions cellulaires dans des tubes stériles de 15 ml et étiquetez-les correctement.
- Centrifuger les échantillons à 751 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Ajouter 2 mL de PBS 1x glacé, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Répétez l’étape de lavage avec 1x PBS pour éliminer les résidus de support.
- Remettez en suspension et cassez la pastille en ajoutant 200 μL de PBS glacé par pipetage.
- Fixez les cellules en ajoutant 2 ml d’éthanol glacé à 70 % dans le tube tout en tourbillonnant doucement.
- Incuber les tubes pendant 30 min à RT et placer les tubes à 4 °C pendant 1 h.
- Retirer les tubes à 4 °C et centrifuger à 751 x g pendant 5 min.
- Ajouter 2 mL de PBS 1x glacé, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Ajouter 500 μL de 1x PBS avec de l’iodure de propidium (50 μg/mL) et de la ribonucléase A (200 μg/mL).
- Incuber 30 min à RT tout en protégeant les échantillons de la lumière.
- Acquérir des données sur cytomètre en flux. Utilisez la diffusion vers l’avant ou sur les côtés (FSC ou SSC) pour sélectionner la population principale de cellules, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche du graphique de densité FSC et SSC et des grappes de cellules en haut à droite du graphique de densité FSC et SSC.
- Analyser les données pour l’identification des populations cellulaires par étape du cycle cellulaire à l’aide d’un logiciel approprié.