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1. Transfection miR-143 et miR-506
ATTENTION : Utilisez des gants en latex, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire lors de la réalisation des expériences décrites. Si nécessaire, utilisez l’enceinte de biosécurité avec le ventilateur de l’armoire allumé, sans bloquer les voies respiratoires ni perturber le flux d’air laminaire. Réglez toujours la fenêtre de protection en verre à la hauteur appropriée, comme décrit par le fabricant.
- Implantez des cellules de CPNPC A549 dans une fiole de25 cm 2/plaque à 6/96 puits dans un milieu DMEM/F12K complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (milieu de culture) dans une hotte de culture tissulaire et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture tissulaire.
- Mettre en suspension les miR-143 et/ou miR-506, ou brouiller les siARN avec un agent transfecteur (2,4 μg de miR ont été mélangés à 14 μL d’agent transfecteur ; voir le tableau des matériaux) dans 500 μL de milieu de transfection et 1,5 mL de sérum et de milieu DMEM/F12K sans antibiotique à une concentration finale de miARN de 100 nM. La quantité de miARN peut nécessiter une optimisation sur différentes cellules et concentrations. Les approches appropriées comprennent la transfection de cellules avec des concentrations croissantes de miARN (c’est-à-dire 50-200 nM) et l’évaluation de la régulation négative de l’expression des gènes d’intérêt.
- Retirer le milieu de culture du ballon/de la plaque et laver une fois avec 1x PBS.
- Ajouter les complexes miARN/agent de transfectation et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 h (la taille du ballon définit le volume d’incubation ajouté).
- Remplacer le milieu par 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pendant 24 h et/ou 48 h.
2. Expression de protéines par une puce à ADN du cycle cellulaire d’anticorps
- Ensemencer 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans des fioles deT25 cm 2 et effectuer une transfection selon le protocole décrit à la section 1, étapes 1 à 5.
- Après 24 h et 48 h, récoltez les cellules par trypsinisation.
- Transférez les suspensions de cellules dans des tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
- Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Ajouter 2 mL de PBS 1x glacé, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Répétez l’étape de lavage avec 1x PBS.
- Ajouter 150 μL de tampon de lyse complété par des inhibiteurs de protéase. Pipette de haut en bas doucement pour perturber les membranes cellulaires.
- Pour éviter toute interférence du tampon de lyse, effectuez un échange de tampon pour remplacer le tampon de lyse par un tampon d'étiquetage, à l'aide des colonnes d'échange de solvant du fabricant.
- Quantifiez la protéine totale à l’aide d’un dosage des ACB.
- Prélever 70 μg d’échantillon de protéines et ajouter un tampon de marquage pour obtenir un volume final de 75 μL.
- Ajouter 100 μL de diméthylformamide (DMF) à 1 mg de réactif de biotine (biotine/DMF).
- Ajouter 3 μL de biotine/DMF à chaque échantillon de protéine (échantillon de protéine biotinylée) et incuber pendant 2 h à la RT.
- Ajouter 35 μL de réactif d’arrêt et mélanger par vortex.
- Incuber les échantillons à RT pendant 30 min.
- Retirez les lames de microarray du réfrigérateur afin qu’elles se réchauffent à RT pendant 1 h avant de les utiliser.
- Effectuer le blocage pour la liaison non spécifique en incubant les lames avec une solution de lait en poudre à 3 % (dans le réactif de blocage fourni par le fabricant) dans une boîte de Pétri avec agitation continue pendant 45 min à RT.
- Lavez les lames avec de l’eau ddH2O (sauf indication contraire, le lavage a lieu avec de l’eau ddH2O).
- Répétez l’étape de lavage ~10x pour éliminer complètement la solution de blocage des surfaces de glissement. Ceci est important pour obtenir un arrière-plan uniforme et bas.
- Retirez l’excès d’eau des surfaces des toboggans et passez à l’étape suivante sans laisser les toboggans sécher.
- Préparez la solution d’accouplement en dissolvant 3 % de lait en poudre dans un réactif d’accouplement.
- Ajouter 6 mL de la solution de couplage et à la quantité totale de l’échantillon de protéine biotinylée préalablement préparé à l’étape 12.
- Placez une lame dans un puits de la chambre de couplage fournie par le fournisseur et ajoutez-y ~6 mL de mélange de couplage de protéines.
note: Assurez-vous que la lame est complètement immergée dans la solution de mélange de couplage de protéines.
- Couvrir la chambre d’accouplement et incuber pendant 2 h à RT avec agitation continue dans un agitateur orbital.
- Transférez les lames dans une boîte de Pétri et ajoutez 30 ml de 1 tampon de lavage. Placez la boîte de Pétri dans un agitateur orbital, agitez pendant 10 minutes et jetez la solution.
- Répétez l’étape 24 2 fois.
- Rincez abondamment les lames avec de l’eau ddH2O comme décrit aux étapes 17 et 18 et passez immédiatement à l’étape suivante pour éviter le dessèchement.
- Ajouter 30 μL de Cy3-streptavidine (0,5 mg/mL) dans 30 mL de tampon de détection.
- Placez la lame dans une boîte de Pétri et ajoutez 30 ml de tampon de détection contenant de la Cy3-streptavidine.
- Incuber dans un agitateur orbital pendant 20 min avec agitation continue à l’abri de la lumière.
note: Cy-3 est un colorant fluorescent. Couvrir d’une feuille d’aluminium ou utiliser dans des conditions sombres pour maintenir l’intensité de la fluorescence.
- Effectuez les étapes 24 à 26 et laissez sécher la lame à l’aide d’un léger jet d’air ou en plaçant la lame dans un tube conique de 50 ml et centrifugez-la à 1300 x g pendant 5 à 10 minutes.
- Placez la glissière dans le support de diapositive et couvrez-la d’une feuille d’aluminium.
- Numérisez la lame dans un scanner à microréseaux avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Dans le cas de Cy3, le pic de longueur d’onde d’excitation est à ~550 nm et le pic d’émission à ~570 nm.
- Analyser les données (voir le Tableau des matériaux pour les logiciels utilisés).