Préparation pulmonaire de souris pour la cytométrie en flux : génération d’une suspension cellulaire à partir de tissu pulmonaire pour l’analyse par cytométrie en flux

Résumé

Source : Moll, H. P., et al. Transplantation orthotopique de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’expression de-L1. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la préparation de la suspension de cellules pulmonaires de souris pour l’analyse cytométrique en flux afin d’étudier l’expression de-L1 des cellules d’adénocarcinome pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation pulmonaire pour la cytométrie en flux

1. Au point final expérimental souhaité, endormir la souris par une injection sous-cutanée d’un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et l’euthanasier par luxation cervicale.
2. Faites tremper la carcasse dans de l’éthanol à 70 % et fixez la souris sur une planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.
3. Faites une incision médiane ventrale et retournez doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. Percez le diaphragme et coupez les côtes avec des ciseaux pour exposer la cavité thoracique.
4. Perfuser les poumons 3 fois avec 6 à 8 ml de PBS glacé à travers le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de 27 G après avoir percé une petite ouverture dans le ventricule gauche pour permettre au sang de sortir. Les poumons doivent être débarrassés du sang et devenir complètement blancs.
5. Retirez les poumons et coupez les lobes en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Transférez les morceaux de poumon dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et incubez-les dans 1,5 mL de tampon de digestion pulmonaire (RPMI, 5 % de FCS, 150 U/mL de collagénase I et 50 U/mL de DNase I).
6. Incuber les morceaux de poumon 30 à 60 min à 37 °C et en les secouant constamment.
7. Transvaser la suspension de cellules pulmonaires à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 mL. Nettoyez la passoire à l’aide du dos d’une seringue stérile de 10 ml et rincez-la avec 15 ml de PBS contenant 2 % de FCS.
8. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse d’ammonium-chlorure de potassium (ACK) et les incuber pendant 5 min à température ambiante pour la lyse des érythrocytes résiduels.
9. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS avec 2 % de FCS et procéder avec le protocole de coloration souhaité pour la cytométrie en flux
   note: Alternativement, les cellules peuvent être remises en suspension dans un RPMI contenant 30 % de FCS et 10 % de DMSO et congelées à l’aide d’un récipient de congélation pour une analyse ultérieure.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire de souris			Isolé à l’interne
souris C57Bl/6			F1 du croisement des deux arrière-plans peut être utilisé (8-12 semaines)
Souris 129S
RPMI 1640 Moyen	Technologies de la vie	11544446
Sérum de veau fœtal	Technologies de la vie	11573397
Solution de pénicilline/streptomycine	Technologies de la vie	11548876
L-Glutamine	Technologies de la vie	11539876
Cétasol (100 mg/mL de kétamine)	Ogris Pharma	Référence 8-00173
Xylasol (20 mg/mL de xylazine)	Ogris Pharma	Référence 8-00178
Pince émoussée	Roboz	Réf. RS8260
Ciseaux d’étudiant Iris	Outils scientifiques fins	Référence 91460-11
DNase I (sans RNase)	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0303S
Collagénase de type I	Technologies de la vie	17100017
Tampon de lysage ACK	Lonza	10-548E