Dosage de l’immunofluorescence : une méthode pour identifier les cellules tumorales capturées sur un fil médical

Résumé

Source : Gallerani, G. et.al., Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer les cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur l’immunofluorescence et l’ADN des poissons. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit la technique de coloration par immunofluorescence de cellules tumorales circulantes capturées sur un fil médical fonctionnalisé. Le fil fonctionnalisé permet d’isoler les CTC in vivo, directement à partir de la circulation sanguine du patient.

Protocole

1. Immuno-ADN FISH sur fil

1. Spike de lignée cellulaire sur fil (support 3D)
   note: La configuration préliminaire implique une sélection précise de lignées cellulaires adhérentes basée sur la positivité EpCAM. Le fil est fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM de sorte que seules les cellules positives à EpCAM sont colorées.
   note: Ne touchez pas la partie fonctionnalisée du fil pour éviter tout dommage.
   note: Toutes les étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
   1. Remettre en suspension tout le contenu d’une fiole T75 (confluence à 80 %) dans un flacon de 5 mL à l’aide de 4 mL de milieu complet ; pour un seul spike-in, environ 2 000 000 de cellules sont recommandées pour maximiser l’adhérence des cellules au fil.
   2. Retirez le fil de son emballage en verre.
   3. Trempez la partie dorée fonctionnalisée du fil dans le flacon, en vous assurant que le bouchon de fil est bien ajusté au flacon. Sceller avec film de laboratoire.
      note: L’utilisation d’un tube de 5 mL est recommandée pour permettre une correspondance correcte entre le bouchon de fil et le flacon.
   4. Incuber pendant 30 min à RT dans un rotateur de tube (angle 0-120).
   5. Rincez le fil trois fois dans une solution 1× PBS à l’aide de 3 flacons propres différents.
2. Fixation et perméabilisation
   prudence: L’acétone est une substance inflammable qui peut irriter les voies respiratoires. N’utilisez que des plastiques résistants à l’acétone ou des récipients en verre (pas de PVC ou de PVDF).
   note: Effectuez ces étapes sous une hotte chimique.
   1. Faites sécher le fil à l’air.
   2. Fixez les cellules en trempant le fil dans une solution d’acétone à 100 % pendant 10 min à RT. Utilisez un tube de 5 mL.
      note: Le bouchon de fil ne doit pas entrer en contact avec le fixateur.
   3. Faites sécher le fil à l’air libre pendant 5 min à RT.
      note: Le protocole peut être mis en pause ici. Le fil doit être stocké à -20 °C. Lors de l’emballage du fil pour un stockage à long terme, placez le bouchon de fil à côté de l’embout fonctionnalisé et insérez soigneusement le fil dans le tube de verre de stockage, en prenant soin de ne pas endommager l’embout fonctionnalisé. Fermez le verre de stockage et rangez-le (verticalement ou horizontalement) à -20 °C.
3. Immunofluorescence Jour 1
   note: Cette étape implique une incubation d’une nuit (~ 16 h).
   1. Laver deux fois dans une solution de PBS 1× à l’aide d’un tube de 5 ml.
   2. Incuber le fil dans un tampon de dilution d’anticorps pendant 30 minutes à RT à l’aide d’un tube de 5 ml.
   3. Préparez 150 μL de mélange d’anticorps avec une dilution d’anticorps primaire monoclonal conjugué à du fluorochrome dans un tampon de dilution d’anticorps, comme spécifié dans la fiche technique. Par exemple, l’anticorps EpCAM-FITC a été utilisé avec une dilution de 1:20.
   4. Utilisez un embout p200 pour effectuer l’incubation, comme suit : extrayez le fil du bouchon de fil et insérez-le doucement dans le plus grand trou de l’embout. Insérez d’abord l’extrémité non fonctionnalisée et tirez lentement le fil à travers le plus petit trou jusqu’à ce que la partie dorée soit juste au-delà du plus grand trou.
   5. Déposez doucement 150 μL du mélange d’anticorps (par exemple anticorps anti-EpCAM_FITC 1:20 dilué) dans l’embout. Pour éviter le risque de formation de bulles, faites tourner doucement le fil jusqu’à ce que la partie fonctionnalisée soit complètement plongée.
   6. Scellez le trou de la pointe. Enrouler un film de laboratoire autour du trou peut aider.
   7. Incuber verticalement pendant une nuit (~ 16 h) dans l’obscurité à 4 °C.
4. Immunofluorescence jour 2
   1. Bloquez l’incubation des anticorps en lavant le fil deux fois dans 1× PBS.
   2. Réinsérez le fil dans son coupe-fil.
      note: Conserver dans 1X PBS à 4 °C dans un flacon de 5 mL jusqu’à ce que le dosage du FISH soit effectué.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
éthanol	Carlo Erba	# 414605
Préadolescent 20	BIO RAD	# 1706531
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Medicago	# 09-9400-100
acétone	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
CAOUTCHOUCCIMENT	Talens royaux	# 95306500
EpCAM-FITC (clone : HEA-125)	Mitenyi	#130-080-301
RPMI 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	Sondes MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		Fil fonctionnalisé
Microscope fluorescent ZEISS Axioskop	Zeiss
Logiciel Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bits	Nikon
Appareil photo numérique Nikon DS-QiMc 12 bits	Nikon	DS-QiMc