1. Prélèvement d’échantillons de plasma
- Prélever 10 ml d’échantillon de sang total dans des tubes Vacutainer avec du K2EDTA enrobé de pulvérisation et le conserver à température ambiante.
note: Pour minimiser l’hémolyse, séparez le plasma dans les 2 heures. Ne stockez pas la totalité du sang à basse température (c’est-à-dire 4 °C) pour éviter le choc thermique et la lyse cellulaire qui entraînent une libération non spécifique de miARN.
- Dans l’espace de 1 h, séparer le plasma par une première étape de centrifugation à 1 258 x g et 4 °C pendant 10 min.
- Transvasez le surnageant plasmatique dans un tube de 15 mL, en évitant soigneusement tout contact avec l’anneau lymphocytaire.
- Centrifugez une seconde fois le plasma à 1 258 x g et 4 °C pendant 10 min.
- Aliquote 1 mL de plasma dans des cryoflacons de 1,5 mL, en évitant de recueillir la fraction plasmatique à la base du tube.
- Stocker toutes les aliquotes à −80 °C, sauf une pour l’évaluation de l’hémolyse. L’analyse moléculaire doit être effectuée dans les 5 semaines.
2. Extraction plasmatique de l’ARN total
- Préparez une solution de 1-thioglycérol/homogénéisation (OMG) avec 20 μL de 1-thioglycérol par mL de solution d’homogénéisation. Étant donné que le 1-thioglycérol est visqueux, pipetez soigneusement pour une mesure précise. Réfrigérez la solution OMG sur de la glace ou à 2-10 °C avant de l’utiliser.
note: La solution de travail est stable à 2-10 °C pendant 1 mois.
- Mettre en suspension la DNase I lyophilisée en ajoutant 275 μL d’eau exempte de nucléases dans le flacon et mélanger doucement (ne pas vortex). À titre d’aide visuelle, ajoutez 5 μL de colorant bleu à la DNase I reconstituée et versez la solution dans des aliquotes à usage unique dans des tubes sans nucléases. Stocker la DNase I reconstituée entre -30 °C et -10 °C.
- À partir de 200 μL de plasma, ajoutez 200 μL de la solution OMG réfrigérée.
- Vortex 15-30 s pour assurer une homogénéisation complète. En cas de formation de mousse, laissez l’échantillon se déposer sur de la glace.
- Ajouter 200 μL de tampon de lyse et 25 μL de protéinase K à l’échantillon homogénéisé et agiter pendant 20 s.
- Incuber les échantillons pendant 15 min dans un thermomélangeur préchauffé à 37 °C.
- Chargez une cartouche pour chaque échantillon sur le plateau de pont de l’instrument et placez le plugger dans la bonne position.
- Transférez le lysat à la position appropriée dans la cartouche de l’instrument.
- Ajouter 5 μL de solution de DNase I à la bonne position dans la cartouche.
- Ajouter 60 μL d’eau sans nucléase à la base de chaque tube d’élution.
- Sélectionnez la méthode « RSC miRNA Tissue » et commencez le cycle de purification automatisé. Les échantillons d’ARN totaux peuvent être conservés à −80 °C.
