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1. Tronçonnage GMA.
- Préparez une solution d’ammoniac à 0,05 % avec de l’eau distillée. Placez le couteau en verre et la biopsie dans le microtome. Alignez soigneusement le bloc de biopsie avec la lame en ajustant le porte-couteau et l’angle du bloc de biopsie de sorte que la lame repose à plat contre la surface du bloc.
- Coupez des sections de 2 μm d’épaisseur à l’aide du microtome à une vitesse de coupe lente et utilisez une pince pour transférer et faire flotter les sections sur l’eau d’ammoniac. Faites flotter les sections pendant 45 à 90 secondes, ce qui permet de récupérer et de déplier en douceur l’antigène.
- Prélever des sections avec une lame de microscope. Vérifiez l’histologie de la biopsie en colorant rapidement au bleu de toluidine.
- Séchez les lames sur une plaque chauffante réglée à 50 °C et appliquez 500 μl de colorant bleu de toluidine filtré sur une section à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Réchauffez la section sur la plaque chauffante jusqu’à ce qu’un anneau vert commence à émerger au bord de la tache, puis lavez-la à l’eau.
- À l’aide d’un microscope optique, vérifiez l’histologie de la biopsie. Les coupes utilisées pour l’immunohistochimie doivent contenir de bonnes zones de lamina propria et d’épithélium non endommagés, avec aussi peu de glandes et aussi peu de muscle lisse que possible.
- Coupez des sections qui ont une bonne histologie et prélevez-les avec des lames de microscope recouvertes de poly L-lysine (recouvertes de PLL) pour la coloration immunohistochimique. Coupez au moins deux sections de chaque biopsie pour l’analyse. Sécher les lames pendant au moins 1 heure. Après séchage, les sections peuvent être enveloppées dans du papier d’aluminium et stockées à -20 °C jusqu’à 2 semaines, ou elles peuvent être immédiatement immunocolorées.
2. Coloration immunohistochimique des biopsies endobronchiques enrobées de GMA
REMARQUE : L’azoture de sodium est toxique. Préparez la solution d’azoture de sodium à 0,1 % dans une hotte et à l’abri des acides. Le contact avec les acides libère des gaz toxiques.
- Dessinez autour des sections à l’aide d’un stylo à pointe de diamant et disposez les lames sur un support de coloration.
- Effectuez un bloc de peroxydase. Préparez une solution de bloc de peroxydase de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % dans une solution d’azoture de sodium à 0,1 %. Appliquer 1 ml du bloc de peroxydase sur les sections et incuber pendant 30 min.
- Préparez une solution de lavage de 0,05 M de solution saline tamponnée au tris (TBS), pH 7,6. Laver les lames dans TBS, 3x 5 min.
- Préparez une solution de bloc BSA à 1 % dans DMEM. Faites-le à l’avance et en grandes quantités, aliquotez-le et congelez-le jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Égouttez les lames et incubez les sections dans une solution en bloc pendant 30 minutes pour bloquer la liaison d’anticorps non spécifiques. Si une liaison non spécifique se produit toujours, inclure une étape d’incubation de 30 minutes avec un bloc sérique de 5 % de la même espèce que l’anticorps secondaire.
- Diluer l’anticorps primaire (CD45 ou CD1a) dans le TBS jusqu’à la concentration souhaitée (CD45 dilué à 1:1 000 ; CD1a dilué à 1:1,00) et appliquez-le sur des lames. Couvrir les sections et incuber toute la nuit à RT.
- Lavez les lames dans TBS trois fois. Diluer l'anticorps secondaire biotinylé (dirigé contre l'espèce hôte de l'anticorps primaire, dans ce cas l'anti-souris F(ab'2) de lapin dans le TBS à la concentration souhaitée (dilution 1:300) et l'appliquer sur des lames. Incuber pendant 2 heures à RT.
- Préparez un complexe de biotine-peroxydase de streptavidine au moins 30 min avant utilisation. Assurez-vous qu’il y en a suffisamment pour couvrir toutes les diapositives. Lavez les diapositives dans TBS trois fois. Appliquez la solution sur les lames et incubez pendant 2 heures à RT.
- Lavez les diapositives dans TBS trois fois. Préparez une solution de substrat de peroxydase 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) (préparée selon les instructions du fabricant). Appliquez-le sur les lames et incubez pendant 20 à 30 minutes ou jusqu’à ce que l’intensité de teinture souhaitée se développe.
- Rincez les lames à l'eau courante du robinet pendant 5 min. Contre-colorez les sections avec une solution d'hématoxyline filtrée de Mayer pendant 2 min. Lavez les lames à l'eau courante du robinet pendant 5 min.
- Égouttez les lames et recouvrez les sections d’un produit de montage aqueux permanent. Faites sécher les lames à 80 °C dans une étuve de séchage. Laissez refroidir les diapositives, puis montez-les avec du DPX et placez une lamelle.