Isolement des exosomes : une technique pour séparer les exosomes du plasma des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules

Résumé

Source : Giallombardo, M., et al. Analyse des miARN exosomaux dans le plasma des patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) par qPCR : un outil de biopsie liquide réalisable. J. Vis. Exp.(2016).

Les exosomes isolés dans le plasma peuvent être utilisés comme moyen non invasif et reproductible pour la détection et le suivi des biomarqueurs pour la détection précoce et la progression de la maladie. Cette vidéo décrit le protocole de séparation des exosomes des échantillons de plasma de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules, qui pourraient être utilisés pour l’extraction d’ADN et de protéines.

Protocole

1. Isolation des exosomes

Remarque : L'isolement des exosomes à partir d'échantillons de plasma, a été réalisé avec un kit commercial, selon le protocole du fabricant et par ajout d'un traitement à l'ARNase : (toutes ces étapes doivent être effectuées avec des équipements de protection individuelle et environnementale et en suivant une procédure légale spécifique pour la manipulation des échantillons biologiques).

1. Prélever 1 ml de plasma de chaque échantillon, conservé à -80 °C, et le placer sur de la glace.
2. Centrifuger l’échantillon à 2 000 × g pendant 20 min à RT ; ce passage est obligatoire afin d’éliminer les cellules et les débris.
3. Transférez le surnageant contenant le plasma propre dans un nouveau tube de 1,5 ml.
4. Centrifuger le nouveau tube à 10 000 × g pendant 20 min à RT.
5. Transférez le surnageant contenant le plasma propre dans un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Ajouter 100 ng/ml d’ARNnase dans le surnageant et incuber le tube à 37 °C pendant 10 min afin de dégrader les ARN circulants.
7. Transférez tout le plasma traité dans un nouveau tube de 2 ml et ajoutez 0,5 volume de 1x PBS.
8. Vortex l’échantillon afin de mélanger les solutions.
9. Ajouter 0,05 volume de solution de protéinase K (incluse dans le kit) à l’échantillon.
10. Vortex l’échantillon, puis incuber à 37 °C pendant 10 min.
11. Ajouter 0,2 volume de tampon de précipitation d’exosomes à l’échantillon et mélanger les solutions par inversion.
12. Incuber l’échantillon à 2 °C à 8 °C pendant 30 min, puis centrifuger l’échantillon à 10 000 × g pendant 5 min à RT.
13. Aspirez et jetez le surnageant. La pastille contient les exosomes isolés.
14. Ajoutez le tampon sélectionné à la pastille d’exosome afin de remettre les exosomes en suspension. Le choix du tampon dépend de l’analyse aval prévue, en l’occurrence :
    1. Ajouter 100 μl de 1x PBS afin d’effectuer une analyse MET.
    2. Ajouter 346,5 μl de tampon de lyse spécifique pour l’extraction de l’ARN (à partir d’un kit commercial) (ATTENTION : risque chimique).
    3. Ajouter 100 μl de tampon de lyse pour l’extraction des protéines (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5 % - PMSF 1 mM - Leupeptine/Aprotinine 10 μg/ml) afin d’effectuer l’analyse Western Blot. (ATTENTION : risques chimiques).
15. Stockez les exosomes remis en suspension à −20 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’isolement d’exosomes totaux (à partir du plasma)	Invitrogen	4484450	Utiliser le traitement à la protéinase K
Ribonucase A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
RNAspin Illustra mini kit 50	GE Soins de santé	Référence : 25-0500-71