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1. Fixation et traitement des tranches de tissu
- Soulevez avec précaution la référence 0 h non cultivée ou la tranche cultivée sur un papier filtre imbibé de PBS.
- Pour ce faire, ajoutez 2 à 3 ml de PBS sur un papier filtre placé dans une plaque de 10 cm. Placez la tranche sur le papier filtre et soulevez le papier filtre à l’aide d’une pince.
- Transférez le papier filtre dans une histocassette et ajoutez une goutte d’hématoxyline diluée (1:1 dans de l’eau désionisée) sur la tranche de tissu pour marquer visiblement la position de la tranche pendant les étapes de traitement suivantes (figure 1D).
- Fermez la cassette et transférez-la dans une solution de formol neutre tamponnée à 4 %. Fixez les mouchoirs pendant la nuit à 4 °C.
note: Tout en plaçant la tranche sur le papier filtre, assurez-vous que la partie supérieure de la tranche est tournée vers le haut ; Cela est nécessaire pour suivre la section supérieure, centrale et inférieure d’une tranche pendant la coupe et l’analyse, comme décrit à l’étape 2.3.
- Le lendemain, transférez les cassettes dans 70 % d’EtOH et procédez immédiatement à l’étape de traitement des tissus enrobés de paraffine.
- Avant le traitement des tissus, lavez les histocasettes à 100 % d’EtOH 2x pendant 10 minutes chacune. Dans ce cas, utilisez une station micro-ondes pour le traitement des tissus. Sélectionnez le programme utilisé pour une épaisseur de tissu de 1 mm et suivez les instructions fournies dans le manuel (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
note: Lorsque vous utilisez d’autres machines de traitement des tissus, utilisez le programme adapté aux échantillons de tissus minces.
- Pour l’enrobage de paraffine, ouvrez une histocassette et utilisez un scalpel pour soulever délicatement la tranche du papier filtre. Jetez le papier filtre et transférez la tranche dans un moule contenant de la parofine liquide.
- Appuyez le tissu contre le fond du moule d’enrobage, par exemple avec un poids plat, pour assurer une coupe uniforme. Placez la partie inférieure de l’histocasette sur le dessus du moule, ajoutez de la paraffine liquide par-dessus. Laissez refroidir le moule sur un pâté froid pendant 30 min, et séparez le moule du bloc de paraffine.
note: Comme alternative à l’intégration horizontale, il est possible d’intégrer la tranche de tumeur verticalement en positionnant la tranche en position verticale. Les sections verticales permettent facilement l’analyse des gradients de viabilité ou de l’expression de marqueurs fonctionnels sur une seule section. L’analyse de gradient avec des tranches intégrées horizontalement nécessite une coupe en paraffine comme décrit à l’étape 2.2.
2. Traitement et analyse des tissus fixés au formol et enrobés de paraffine (FFPE)
- Préparez des coupes minces de 4 μm de blocs de coupe de tissu FFPE à l’aide d’un microtome. Lors de la section, ajustez l’angle du bloc de manière à ce que la surface du bloc soit orientée horizontalement par rapport à la lame ; Ceci est nécessaire pour obtenir des coupes uniformes dans tout le tissu.
- Pour permettre la capture d’un gradient de viabilité potentiel induit par la culture, la migration cellulaire à travers les tranches ou les gradients d’expression des biomarqueurs à travers les tranches cultivées, collectez des sections des couches supérieure, centrale et inférieure de chacune des tranches de tissu sur les lames d’objets, comme expliqué ci-dessous.
- Prélevez des coupes tissulaires séquentielles de la tranche de tissu enrobée de paraffine d’abord sur la partie supérieure des lames de verre. Continuez à collecter les sections des couches de tissus plus profondes jusqu’au milieu, puis la partie inférieure des lames de verre (Figure 1E).
note: Pour accueillir trois sections sur une lame de verre, coupez l’excès de paraffine entourant la tranche de tissu incrustée.
- Laissez les coupes sécher pendant la nuit à 37 °C et procédez à la coloration H&E ou à l’immunohistochimie comme décrit ci-dessous.
note: Une perte d’antigénicité peut se produire lorsque les sections FFPE sont stockées à des températures élevées ou pendant de longues périodes. Il est recommandé de conserver les coupes en paraffine à 4 °C et les analyses IHC doivent être effectuées dans les 6 mois suivant la section.
- Pour la coloration H&E, déparaffinisez et réhydratez les sections de paraffine comme suit : xylène 3x pendant 5 min, 100 % EtOH 3x pendant 1 min, 96 % EtOH 2x pendant 1 min, 70 % EtOH 1 x 1 min et eau désionisée 2x pendant 1 min.
- Incuber les sections dans une solution d’hématoxyline fraîchement filtrée pendant 10 minutes et laver à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Tremper les sections dans de l’alcool acide (1 % HCl dans 70 % EtOH) pendant 2 fois, et laver à l’eau courante du robinet pendant 5 min, suivi d’une incubation avec 0,5 % d’éosine pendant 2 min.
- Après l’étape d’éosine, déshydrater les sections en immergeant les lames dans des solutions d’alcool et de xylène, comme suit : 96 % EtOH 2x pendant 15 s, 100 % EtOH 3x pendant 30 s, xylène 3x pendant 1 min. Enfin, intégrez les sections dans un support de montage à base de xylène.
