$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparation des cellules et du milieu
- Préparez le milieu en utilisant 240 ml de milieu modifié Dubecco (IMDM) d’Iscove et 50 ml de sérum fœtal bovin. Ne décongelez pas le sérum fœtal bovin dans un bain d’eau chaude, car les augmentations rapides de la température peuvent compromettre la stabilité sérique. Mélanger 240 μl de gentamicine 50 mg/ml et 5 ml de pénicilline/streptomycine 100x dans une fiole de culture standard et ajouter au milieu. Conserver le milieu à 4°C.
- Ensemencer U937 à ~4 x 104 cellules/ml dans une fiole de25 cm à l’aide du milieu préparé. Évaluez la concentration et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules TC20 et de l’exclusion du bleu de trypan en plaçant 15 à 20 μl de cellules et 15 à 20 μl de bleu de trypan dans un tube de micro-centrifugeuse et en mélangeant le contenu. Pipetez 15 à 20 μl de ce mélange dans une lame d’échantillonnage TC20 et lancez le comptage en plaçant la lame dans le compteur de cellules TC20.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2, et vérifier la viabilité cellulaire à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan et du compteur de cellules TC20. Lorsque les cellules ont atteint une concentration appropriée et/ou ont été traitées avec des sonosensibilisants pendant une période appropriée, transférer 3 ml de cellules de la fiole de culture dans un flacon en verre à scintillation de 20 ml. Dans ce protocole, cultivez des cellules U937 pendant 48 heures, puis traitez-les avec 0,5, 1 ou 5 mM de MeβCD pendant 30 minutes pour épuiser suffisamment le cholestérol des cellules avant la sonication.
2. Sonication cellulaire
- Dégazer l’eau distillée déminéralisée à l’aide d’un vide et d’une fiole Buchner. Transférez l’eau dans la corne de la tasse et remplissez-la à un niveau de 15 mm au-dessus du haut de la corne. Le processus de sonication provoque un dégazage supplémentaire de l’eau pendant une période de quelques minutes et peut entraîner des incohérences au cours de l’expérience si le système n’est pas exécuté avant la sonication de l’échantillon. Par conséquent, faites fonctionner le système pendant ~7 min avant de sonication de l’échantillon.
- Fixez le flacon à scintillation contenant les cellules au dispositif de maintien. Ensuite, fixez le dispositif de maintien sur le dessus de la corne de la tasse et réglez-le à une élévation de 15 mm par rapport au haut de la corne (à la surface de l’eau à l’aide du mécanisme coulissant).
- Les cellules sont généralement soniquées à l’aide de trois impulsions d’ultrasons de 1 seconde, avec un espacement de 1 seconde entre chacune de ces impulsions. Pour ce protocole, sonicez les cellules à 33 % et 50 % d’amplitude en utilisant le dosage par impulsions mentionné ci-dessus.
3. Évaluation des cellules pour les dommages post-sonication
- Évaluez les dommages et la viabilité des cellules suspendues à l’aide du bleu trypan et du compteur de cellules TC20. De plus, analysez l’échantillon à l’aide d’un compteur Z2. Pour l’analyse par compteur Z2, pipeter une suspension cellulaire de 100 μl dans 20 ml de solution saline isotonique (rapport 200:1). Avant l’analyse, rincez l’ouverture de l’analyseur de particules Z2 au moins deux fois avec une solution saline isotonique. Placez l’échantillon Z2 dans le support de compteur et soulevez la plate-forme jusqu’à l’ouverture avant de lancer le comptage.
- Acquérez les données des compteurs TC20 et Z2 à l’aide du logiciel fourni par le fabricant. Analysez ces données pour détecter les dommages cellulaires, la viabilité et la création de débris cellulaires par sonication.