XTT Assay : un test colorimétrique pour évaluer la viabilité cellulaire et l’activité mitochondriale

Résumé

Trendowski, M., et al. Génération et analyse quantitative des ultrasons pulsés à basse fréquence pour déterminer la sensibilité sonore des cellules néoplasiques non traitées et traitées. J. Vis. Exp. (2015)

Cet article décrit le protocole du dosage XTT qui est un test colorimétrique permettant d’évaluer la viabilité cellulaire et l’activité mitochondriale.

Protocole

1. Dosage XTT pour déterminer la viabilité cellulaire et l’activité mitochondriale des cellules U937 et THP1 traitées

1. Avant les tests XTT, cultivez des cellules U937 et THP1 dans les mêmes conditions. Prétraiter les cellules avec la même gamme de concentration de MeβCD pendant 30 minutes avant la sonication. Utilisez les mêmes paramètres d’échographie qu’auparavant, sauf que les cellules sont maintenant soniquées à l’aide d’une plage de 1 à 3 impulsions d’une seconde espacées d’une seconde pour développer une gamme de dommages que le kit XTT peut évaluer.
   note: Bon nombre de ces étapes sont tirées directement du manuel du kit XTT et ne sont répétées que pour la commodité des laboratoires intéressés.
2. Prélever les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 10 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de croissance décrit précédemment. Réinjectez les cellules U937 à 100 μl par puits dans une plaque de microtitration à 96 puits à fond plat en trois exemplaires, puis répétez l’opération pour les cellules THP1 à l’aide d’une plaque séparée à 96 puits. Inclure 3 puits de contrôle contenant 100 μl de milieu de croissance complet seul comme lectures d’absorbance à blanc. Ensuite, incubez les plaques inoculées pendant 24 heures.
3. Décongelez deux aliquotes du réactif XTT et du réactif d’activation à 37 °C avant utilisation. Agitez doucement les aliquotes jusqu’à l’obtention de solutions claires. Ajoutez 0,1 ml du réactif d’activation à 5,0 ml du réactif XTT, ce qui forme suffisamment de solution XTT activée pour un test sur plaque de microtitration à 96 puits. Répétez le processus pour l’autre plaque.
4. Ajouter 50 μl de la solution XTT activée dans chaque puits. Remettre la plaque dans l’incubateur de CO₂ de culture cellulaire pendant 2 heures. Secouez doucement la plaque après la période d’incubation pour répartir uniformément la couleur orange dans les puits positifs. Mesurez l’absorbance des puits de dosage contenant les cellules et des puits de contrôle du bruit de fond vierge à une longueur d’onde comprise entre 450 et 500 nm à l’aide d’un lecteur de plaque de microtitrage.
5. Soit mettre à zéro le lecteur de plaque de microtitration à l’aide des puits de contrôle vierges, soit soustraire sa valeur moyenne des résultats spécifiques. Mesurez à nouveau l’absorbance de tous les puits d’analyse à une longueur d’onde comprise entre 630 et 690 nm et soustrayez les valeurs des valeurs obtenues à 450-500 nm. Remarque : Cette deuxième détermination de l’absorbance permet d’éliminer les lectures non spécifiques des résultats d’analyse. Le test XTT a été répété quatre fois pour les deux lignées cellulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco's Medium modifié d'Iscove avec NaHCO3 et 25 mM Hepes	Technologies de la vie	12440079
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor avec Cuphorn de 3 po (25 mm)	Échographies Branson	Tél. : 101-063-726	sonication appareil
Pointes One 100 μl et 1 000 μl	Scientifique américain	1120-1840, 1126-7810
Micropipette de 100 μl	Wheaton	851164
Micropipette 1000 μl	Wheaton	851168
Forma Scientific Eau à deux chambres Incubateur chemisé	Forma Scientific	Référence 3131
Kit de dosage de la prolifération cellulaire XTT	ATCC	30-1011K
Lecteur de microplaques à 96 puits	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 Cellules de leucémie monocytaire humaine	ATCC	CRL1593.2
Cellules de leucémie monocytaire humaine THP1	ATCC	TIB-202

Le