1. Solutions et réactifs
- RPMI complet
- Ajoutez 56 ml de sérum de veau fœtal (FCS) et 5,5 ml de 200 mM de L-glutamine dans un flacon de 500 ml de milieu RPMI-1640.
- Solution mère BrdU
- Préparer 32,5 mM de BrdU (10 mg/ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
- BrdU RPMI complet
- Ajouter 6,2 μl de solution mère de BrdU à 10 ml de RPMI complet.
- La solution DNase
- Préparez 1 mg de DNase/ml dans du DPBS.
- Tampon de coloration
- Préparez du FCS inactivé à la chaleur à 3 % et de l’azoture de sodium à 0,09 % dans du DPBS.
- Reportez-vous à la liste des matériaux pour les définitions du tampon de fixation, du tampon de perméabilisation et du tampon de lavage.
2. Cellules
REMARQUE : Les cellules n’ont pas été cultivées pendant plus de 6 mois. Cette méthode est directement adaptable à toute lignée cellulaire non adhérente avec des ajustements de la densité cellulaire et des milieux de culture. Utilisez des cellules qui se développent de façon exponentielle au début de l’expérience.
- Maintenir les cellules NALM6 dans les flacons de culture T-75 dans Complete RPMI. Effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles à l’aide d’une enceinte de biosécurité de classe II.
- Maintenir les cellules NALM6 entre 1-2 x 106 cellules par ml en divisant la culture trois fois par semaine.
- Incuber à 37 °C dans 5 % de CO2 dans l’air.
3. Marquage par impulsions des cellules avec BrdU
ATTENTION : Manipulez BrdU avec précaution car il s’agit d’un mutagène et tératogène potentiel.
- Cellules de centrifugation à 150 x g pendant 5 min
note: Le transfert de cellules dans un milieu frais améliore la reproductibilité des résultats.
- Effectuez une numération cellulaire et remettez les cellules en suspension dans l’IPRP complet à raison de 2 x 106 cellules/ml.
- Diluez les cellules 1 en 2 avec BrdU Complete RPMI produisant une concentration cellulaire finale de 1 x 106 cellules/ml.
- Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 45 min, puis diluer les cellules 1 sur 10 avec du RPMI complet. Centrifugez les cellules à 150 x g pendant 5 min et jetez soigneusement tout le surnageant.
- Rémettez les cellules en suspension dans un petit volume (~100 μl) de RPMI complet, effectuez une numération cellulaire et ajustez à 1 x 106 cellules/ml.
- Pipeter 1 ml de cellules dans les puits d’une plaque de 48 puits. Pipeter 1 ml de DPBS dans les puits inoccupés pour obtenir des résultats plus reproductibles.
- Incuber à 37 °C dans 5 % de CO2 dans l’air pendant les moments souhaités, ici 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 et 24 hr.
note: La durée dépendra de ce que le plan expérimental vise à mesurer.
- Transférez toutes les cellules dans des tubes FACS à l’aide d’une pipette. Rincer le puits séquentiellement avec des volumes de 1 ml de PBS jusqu’à un volume total final de 5 ml.
- Centrifugez à 150 x g pendant 5 min et retirez soigneusement tout le surnageant. Les cellules sont prêtes pour la coloration, effectuez-la (section 4) immédiatement.
4. Coloration cellulaire
REMARQUE : Si une coloration de surface des cellules est nécessaire, effectuez-la avant la fixation, en veillant à ce que les cellules soient maintenues à 4 °C tout au long de la fixation.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon de coloration (pour une coloration de surface facultative, ajouter le volume recommandé d’anticorps aux antigènes de surface et incuber pendant 30 min à 4 °C).
- Ajouter 1 ml de tampon de coloration, centrifuger pendant 5 min à 150 x g et jeter le surnageant.
Remarque : L’anticorps spécifique, la concentration, le temps d’incubation, etc. varient en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques.
