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1. Solutions et réactifs
- RPMI complet
- Ajoutez 56 ml de sérum de veau fœtal (FCS) et 5,5 ml de 200 mM de L-glutamine dans un flacon de 500 ml de milieu RPMI-1640.
- La solution DNase
- Préparez 1 mg de DNase/ml dans du DPBS.
- Tampon de coloration
- Préparez du FCS inactivé à la chaleur à 3 % et de l’azoture de sodium à 0,09 % dans du DPBS.
- Reportez-vous à la liste des matériaux pour les définitions du tampon de fixation, du tampon de perméabilisation et du tampon de lavage.
2. Coloration cellulaire
REMARQUE : Si une coloration de surface des cellules est nécessaire, effectuez-la avant la fixation, en veillant à ce que les cellules soient maintenues à 4 °C tout au long de la fixation.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon de coloration (pour une coloration de surface facultative, ajouter le volume recommandé d’anticorps aux antigènes de surface et incuber pendant 30 min à 4 °C).
- Ajouter 1 ml de tampon de coloration, centrifuger pendant 5 min à 150 x g et jeter le surnageant.
note: L’anticorps spécifique, la concentration, le temps d’incubation, etc. varieront en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques.
- Fixation et perméabilisation
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon de fixation et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger pendant 5 min à 150 x g et jeter le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon de perméabilisation et incuber les cellules pendant 10 min sur de la glace.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger pendant 5 min à 150 x g et jeter le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de tampon de fixation par tube et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger pendant 5 min à 150 x g et jeter le surnageant.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici si nécessaire. Les cellules fixées sont stables pendant plusieurs jours à 4 °C si elles sont remises en suspension dans un tampon de coloration. Retirez le tampon de coloration après la centrifugation avant de continuer.
- Traitement de la DNase
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de solution de DNase (30 μg de DNase/106 cellules) et incuber les cellules pendant 1 heure à 37 °C.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger à 150 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Coloration des anticorps
REMARQUE : La coloration pour les marqueurs intracellulaires autres que BrdU peut être effectuée en même temps que la coloration BrdU.
- IMPORTANT : Préparez des contrôles de compensation composés de cellules non colorées et de cellules marquées avec chaque fluorochrome. Idéalement, utilisez les mêmes anticorps pour les contrôles de compensation que ceux utilisés dans les tubes expérimentaux. Cependant, si cela n’est pas possible, substituez les anticorps aux antigènes fortement exprimés conjugués au même fluorochrome.
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μl de tampon de lavage et ajouter 1 μl/106 cellules d’anticorps BrdU.
REMARQUE : Des anticorps directement conjugués à d’autres antigènes intracellulaires spécifiques peuvent également être ajoutés.
note: Les anticorps dirigés contre l’histone H3 phosphorylée sur Ser10 peuvent être utilisés pour discriminer les cellules dans G2 et M, l’histone H3 est phosphorylée sur Ser10 pendant la mitose. Les anticorps contre cdc2 phosphorylés sur Tyr15 peuvent être utilisés pour détecter les cellules qui se sont engagées dans la mitose.
- Incuber les cellules pendant 20 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger les cellules à 150 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- ADN de coloration pour l’analyse du cycle cellulaire
- Détachez la pastille et ajoutez 20 μl de la solution de 7-AAD (0,25 μg).
REMARQUE : Il est essentiel d’utiliser une quantité constante de 7-AAD/cellule.
- Remettre les cellules en suspension dans 1 ml de tampon de coloration.