Co-culture 2D de cellules leucémiques avec des BMSC : une méthode pour obtenir des sous-populations de cellules leucémiques

Résumé

Source : Slone, W. L. et al. Modélisation de la leucémie résistante à la chimiothérapie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit la technique de co-culture 2D à long terme de cellules leucémiques avec des cellules stromales de moelle osseuse afin d’étudier leur interaction avec le microenvironnement de la moelle osseuse. Le modèle de coculture 2D utilise les cellules de leucémie lymphoblastique aiguë et le stromal ou les ostéoblastes de la moelle osseuse qui influencent le phénotype des cellules tumorales. Cette étude soutiendra l’étude des mécanismes qui sous-tendent la survie des cellules leucémiques soutenue par la moelle osseuse pendant l’exposition à la chimiothérapie.

Protocole

1. Préparation avancée

1. Culture de cellules stromales et d’ostéoblastes de moelle osseuse.
   1. Maintenir la BMSC ou l’OB à 37 °C dans 6 % de CO₂ et cultiver sur des plaques de culture tissulaire de 10 cm jusqu’à ce que la confluence de 90 % soit atteinte.
   2. Trypsinisez les cellules BMSC ou OB et divisez-les 1:2 sur de nouvelles plaques de 10 cm. Les cellules sont cultivées selon ces normes jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires à la co-culture leucémique.

2. Établir et maintenir la co-culture

1. Ajouter 5-20 x 10⁶ cellules leucémiques dans 10 ml de milieu de culture spécifique de la tumeur sur une plaque BMSC ou OB confluente à 80 %-90 %.
   REMARQUE : Notre laboratoire maintient les co-cultures à 37 °C dans 5 %_d’O2 pour mieux récapituler le microenvironnement de la moelle osseuse qui varie de 1 % à 7 %. Cependant, le maintien des co-cultures à cette tension d’oxygène n’est pas essentiel pour l’établissement des trois sous-populations leucémiques et est à la discrétion du laboratoire.
2. Tous les 4^jours, prélever tous les milieux sauf 1 ml (y compris les cellules leucémiques en suspension) et les remplacer par 9 ml de milieux de culture leucémiques frais. Lorsque vous retirez 9 ml de milieu de la plaque, veillez à ne pas perturber les cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) ou la couche adhérente de l’ostéoblaste (OB).
   1. Retirez le support en inclinant la plaque sur le côté et aspirez le support dans le coin de la plaque. De plus, lors de l’ajout de support frais, assurez-vous d’ajouter des gouttes dans le coin de la plaque contre le flanc pour assurer une perturbation minimale de la couche adhérente BMSC ou OB
   .
3. Après le 12^e jour de la co-culture, rincer les cellules leucémiques de la couche BMSC ou OB en pipetant doucement le milieu de culture de la boîte de haut en bas sur la boîte environ 5 à 10 fois, puis prélever dans un tube conique de 15 ml. Réensemencer sur une nouvelle plaque de BMSC ou OB confluente à 80 % à 90 %, comme décrit à l’étape 2.1.
   REMARQUE : Le rinçage doux de la co-culture tel que décrit à l’étape 2.3 éliminera les cellules leucémiques en suspension et en phase brillante sans perturber la monocouche BMSC ou OB. Cela permet uniquement de transférer les cellules tumorales vers la plaque de co-culture suivante. Ce cycle de 12 jours peut être répété autant de fois que nécessaire en fonction des besoins de l’utilisateur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture cellulaire 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Référence 664160
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml	Produits médicaux dans le monde entier	41021037	Utilisé pour la collecte de cellules
Milieux de culture
Milieux de culture d’ostéoblastes	PromoCell	C-27001	Pour les milieux ostéoblastiques humains
Supports RPMI 1640	Mediatech, Inc.	Référence 15-040	Pour la préparation des milieux tumoraux
Cellules adhérentes
Ostéoblastes humains	PromoCell	C-12720	Les ostéoblastes humains ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur.
Cellules stromales de Morrow d’os humain	Carotte d’échantillon biologique WVU		cellules stromales primaires anonymisées de leucémie humaine et de moelle osseuse (BMSC) ont été fournies par le Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core et la banque de tissus du département de pathologie de l’Université de Virginie-Occidentale
Cellules leucémiques
Reh	ATCC	ATCC-CRL-8286	Les cellules REH ont été cultivées selon les recommandations du fournisseur et les milieux recommandés.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Les SD-1 ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur et les milieux recommandés.

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