Récolte de sous-populations leucémiques : une méthode de séparation spatiale des sous-populations de cellules leucémiques à partir de la co-culture 2D

Abstract

Source : Slone, W. L., et al. Modélisation de la leucémie résistante à la chimiothérapie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit une méthode de séparation spatiale de trois sous-populations de cellules leucémiques : les cellules leucémiques suspendues flottant librement dans le milieu, les cellules leucémiques en phase brillante adhérant à la surface de la monocouche de cellules stromales mésenchymateuses et les cellules leucémiques en phase faible qui ont migré sous la monocouche de cellules stromales mésenchymateuses à partir de la co-culture 2D.

Protocol

1. Séparation de 3 sous-populations au sein de la co-culture

1. Collection de la sous-population tumorale en suspension (S).
   1. Aspirez le milieu de la plaque de co-culture à l’aide d’une pipette et réappliquez doucement le même milieu pour rincer la plaque et recueillir les milieux contenant des cellules leucémiques dans un tube conique de 15 ml. Les cellules leucémiques collectées constituent la sous-population S.
2. Collection de la sous-population tumorale de phase brillante (PB).
   1. Ajouter 10 ml de milieu frais sur la plaque de coculture. Rincer vigoureusement en pipetant le milieu ajouté de haut en bas environ 5 fois pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes, mais pas assez fort pour déloger le composant adhérent BMSC/OB.
   2. Aspirer à l’aide d’une pipette et recueillir le milieu dans un tube conique de 15 ml. Les cellules collectées constituent la sous-population PB.
3. Collection de la sous-population tumorale de phase Dim ().
   1. Rincer la plaque avec 1 ml de PBS pour enlever le support restant. Trypsiniser la plaque de co-culture avec 3 ml de trypsine et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
   2. Retirez la plaque de l’incubateur et tapotez doucement les côtés de la plaque pour déloger les BMSC/OB adhérents.
   3. Ajoutez 1 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et pipetez de haut en bas 3 à 5 fois pour séparer les agrégats à grandes cellules.
   4. Prélever le milieu avec des cellules dans un tube conique de 15 ml. Ces cellules sont la sous-population de la MP non purifiée avec BMSC/OB également.
4. Centrifuger 3 sous-populations isolées à 400 x g pendant 7 min. Aspirer et jeter le surnageant, puis remettre individuellement les granulés en suspension dans un milieu préchauffé de 1 ml. Les cellules sont prêtes à être chargées sur une colonne G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml	Produits médicaux dans le monde entier	41021039	Solution de préservation pour Échantillons de cytologie
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml	Novacyt	Na	Utilisé pour la collecte de cellules
Sérum fœtal bovin	sigma	Réf. F6178
0,05 % de trypsine	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	Référence 25-053-CI
Boîtes de culture cellulaire 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Référence 664160
Milieux de culture
Milieux de culture d’ostéoblastes	PromoCell	C-27001	Pour les milieux ostéoblastiques humains
Supports RPMI 1640	Mediatech, Inc.	Référence 15-040	Pour la préparation des milieux tumoraux
Lignées cellulaires
Ostéoblastes humains	PromoCell	C-12720	Les ostéoblastes humains ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur.
Cellules stromales de Morrow d’os humain	Carotte d’échantillon biologique WVU		cellules stromales primaires anonymisées de leucémie humaine et de moelle osseuse ont été fournies par le Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core et la banque de tissus du département de pathologie de l’Université de Virginie-Occidentale. Les cultures BMSC ont été établies comme décrit précédemment (*)
Cellules leucémiques
Reh	ATCC	ATCC-CRL-8286	Les cellules REH ont été cultivées selon les recommandations du fournisseur et les milieux recommandés.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Les SD-1 ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur et les milieux recommandés.