Tri des cellules de leucémie sur colonne G-10 : une méthode pour purifier les cellules de leucémie lymphoblastique aiguë à partir de cellules stromales de la moelle osseuse

Abstract

Source : Slone, W. L.,et al. Modélisation de la leucémie résistante à la chimiothérapie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit la séparation des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë des cellules stromales de la moelle osseuse à l’aide de colonnes de dextran G-10 réticulé de type gel dix. Cette méthode aide à récupérer la population de cellules tumorales qui ont migré sous les cellules stromales adhérentes de la moelle osseuse, générant une population de cellules tumorales « dim de phase ».

Protocol

1. Chargement des cellules de co-culture sur la colonne G10

REMARQUE : Assurez-vous que le robinet d’arrêt est complètement fermé avant d’ajouter un support contenant des cellules à la colonne G10. De plus, chaque sous-population doit être analysée sur une colonne G10 distincte afin de ne pas introduire de biais entre les populations dans l’analyse en aval.

1. À l’aide d’une pipette de 1 000 μl, ajouter 1 ml de chaque sous-population cellulaire dans un milieu préchauffé dans une colonne G10 distincte dans le sens de la goutte. Assurez-vous que le milieu contenant les cellules reste sur le dessus ou à l’intérieur de la pastille G10. Laisser les cellules incuber sur une pastille de G10 pendant 20 min à RT.
   note: Le robinet d’arrêt reste fermé pendant toute la durée de l’incubation.

2. Collecte de cellules leucémiques à partir de la colonne G10

1. Ajouter 1 à 3 ml de média préchauffé dans chaque colonne G10. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez le fluide sortir lentement de la colonne dans le sens de la goutte.
   note: Il est crucial de maintenir un débit lent de la colonne, sinon la pastille G10 contenant du BMSC/OB peut être évacuée de la colonne et contaminer les cellules leucémiques isolées.
2. Continuer à ajouter le milieu préchauffé par petits incréments (1 à 2 ml) dans la colonne G10 jusqu’à ce qu’un total de 15 à 20 ml ait traversé la colonne et ait été recueilli. Fermer le robinet d’arrêt et le tube de collecte du bouchon.
   note: Si une pastille de particules G10 est observée au fond du tube de collecte, retirez délicatement le média du tube en laissant la pastille de particules G10 intacte et transférez-la dans un nouveau tube.
3. La centrifugeuse a collecté un milieu à 400 x g pendant 7 min à RT. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un tampon approprié pour l’application en aval.
4. Les cellules sont maintenant une population pure de cellules leucémiques exemptes de contamination BMSC ou OB et sont prêtes à être appliquées à des applications en aval à la discrétion de l’utilisateur.
   REMARQUE : La viabilité des cellules leucémiques doit rester inchangée lors du passage des cellules à travers les colonnes G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perles G10 sephadex	sigma	Référence G10120	Appelées particules de dextran réticulé de type gel 10
Seringue stérile de 10 ml	Bd	309604
Robinets d’arrêt 1 voie	World Precision Instruments, Inc.	Référence 14054-10
Ostéoblastes humains	PromoCell	C-12720	Les ostéoblastes humains ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur.
Cellules stromales de Morrow d’os humain	Carotte d’échantillon biologique WVU		cellules stromales primaires anonymisées de leucémie humaine et de moelle osseuse ont été fournies par le Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core et la banque de tissus du département de pathologie de l’Université de Virginie-Occidentale. Les cultures BMSC ont été établies comme décrit précédemment (*)
0,05 % de trypsine	Mediatech, Inc.	Référence 25-053-CI
Reh	ATCC	ATCC-CRL-8286	Les cellules REH ont été cultivées selon les recommandations du fournisseur et les milieux recommandés
laine de verre	Pyrex	Référence 3950
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml	Produits médicaux dans le monde entier	41021039	Utilisé comme tubes de collecte
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml	Produits médicaux dans le monde entier	41021037	Utilisé pour la collecte de cellules
Sérum fœtal bovin	sigma	Réf. F6178
SD-1	DSMZ	ACC 366	Les SD-1 ont été cultivés selon les recommandations du fournisseur et les milieux préconisés
Boîtes de culture cellulaire 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Référence 664160