Prélèvement sanguin rétro-orbitaire : méthode d’isolement de cellules mononucléées du sinus rétro-orbitaire d’une souris

Résumé

Source : Mopin A. et al. Un protocole détaillé pour la caractérisation de la lignée cellulaire murine C1498 et de son modèle murin de leucémie associé. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo décrit une méthode d’échantillonnage pour la collecte de sang périphérique à partir du sinus rétro-orbitaire d’une souris et l’isolement supplémentaire de cellules mononucléées dans le sang avec centrifugation à gradient de densité.

Protocole

1. Prélèvement sanguin orbitaire rétro

1. Effectuer un prélèvement sanguin rétro-orbitaire juste avant l’euthanasie dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire et sous une lampe chauffante pour prévenir l’hypothermie.
2. Pour l’anesthésie, utilisez de la kétamine à 150 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg. Préparez la solution anesthésique en diluant 1,5 ml de kétamine et 0,5 ml de xylazine dans 18 ml de solution de PBS.
3. Insérez un tube capillaire dans le canthus médial de l’œil. Le sang remontera du sinus orbitaire dans le tube capillaire. Contrôlez le saignement en exerçant une légère pression sur l’œil à l’aide d’une éponge de gaze stérile.
   note: Un volume de 100 à 200 μl de sang peut être prélevé à l’aide de cette technique.
4. Recueillez le sang dans un tube EDTA et stockez l’échantillon sur de la glace avant d’isoler les cellules mononucléaires.

2. Isolement des cellules mononucléées sanguines

1. Transvasez l’échantillon de sang (100 à 200 μl ; obtenu à l’étape 1.1) dans un tube de microcentrifugation et ajoutez une solution PBS/1 mM d’EDTA jusqu’à ce que le volume de la solution atteigne 500 μl. Appliquez soigneusement 500 μl de solution de séparation sous la solution contenant le sang à l’aide d’une aiguille de 30 G et d’une seringue de 1 ml. Ne mélangez pas le sang et la solution de séparation.
2. Centrifuger les tubes à 800 x g (sans frein) pendant 20 min à RT. Après centrifugation, prélever l’anneau cellulaire (la couche blanche opaque) à l’aide d’une pipette. Transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation.
   note: La couche blanche opaque contient des lymphocytes ainsi que des monocytes et apparaît entre la couche inférieure - la solution de séparation - et la couche supérieure.
3. Ajouter 1 ml de solution de PBS et centrifuger le tube à 350 x g pendant 10 min. Remettre les cellules en suspension dans 600 μl de tampon FACS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3,59713E+12
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml)	Le CEVA
Solution PBS (1x concentré)	ThermoFisher Scientific	Référence 14190
Solution EDTA ultra pure 0,5 M, pH 8,0	ThermoFisher Scientific	Référence 15575
Solution de séparation (souris Pancoll	PANBIOTECH	Réf. P04-64100
Tube EDTA	Greiner Bio-One	454034
Pipette Pasteur 150 mm (tube capillaire)	Fisherbrand	Référence 1154-6963
Tubes de cytométrie en flux (bleu)	Beckman Coulter	2523749
Tube de microcentrifugation (1,5 ml)	ThermoFisher Scientific	Tél. : 05-408-129
Éponges de gaze stériles	URGO	Référence 501580
Aiguille de 30 g	Becton et Dickinson	Référence 304000
Seringue de 1 ml	Terumo	SS-01T
Cytocentrifugeuse Shandon Cytospin 3	ThermoFisher Scientific