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1. Caractérisation in vitro de la lignée cellulaire C1498
- Culture in vitro de cellules C1498
- Préparez le milieu complet du RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 5 ml de pénicilline (100 U/ml)-streptomycine (100 μg/ml), 500 μl de 50 mM de β-mercaptoéthanol, 5 ml d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES), 5 ml d’acides aminés non essentiels et 5 ml de pyruvate de sodium à 500 ml de milieu RPMI.
- Cultivez la lignée cellulaire C1498 dans un RPMI complet. Récoltez les cellules en suspension par pipetage et transférez-les dans un tube de 50 ml. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min, et retirer le surnageant.
- Ajouter 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x), centrifuger à 350 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans 10 ml de tampon FACs (2,5 g de poudre d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 ml de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M dans 500 ml de solution de PBS). Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules Thoma après avoir coloré les cellules au bleu de trypan.
2. Préparation d’une suspension cellulaire sur lames pour la microscopie
- Laver 10 à6 cellules C1498 récoltées (obtenues à l’étape 1.1.4) avec 5 ml de tampon FACs froid deux fois, et diluer les cellules dans 1 ml de tampon FACs froid. Placez les tubes sur de la glace.
- Placez les lames dans des chambres jetables avec des cartes filtrantes pré-attachées et placez-les dans une cytocentrifugeuse.
- Ajoutez 100 μl de tampon FACs dans chaque chambre et carte filtrante, et faites-les tourner pendant 2 min à 4,52 x g.
- Ajoutez 100 μl de cellules dans chaque chambre et carte filtrante, et faites tourner les cellules à 4,52 x g pendant 2 min.
- Retirez soigneusement les lames des chambres et faites-les sécher à l’air libre avant de les teindre avec la teinture May-Grünwald Giemsa.
3. Coloration May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Teintez les cellules (préparées en section 2) en immergeant les lames dans un bocal Coplin contenant la solution de May-Grünwald pendant 3 min.
- Transférez les lames dans un bocal Coplin contenant la solution tampon de pH 6,8 pendant 1 min.
- Tachez les lames en les plaçant dans un bocal Coplin contenant la solution Giemsa R (diluée à 1/20 dans une solution tampon de pH 6,8) pendant 10 min. Lavez les lames à l’eau neutre (pH 7) pendant 10 sec.
- Égouttez et faites sécher les lames à l’air. Montez les lames en appliquant une goutte de support de montage 2 sur les cellules. Placez un bord du verre de protection sur la lame et abaissez-le soigneusement sur les cellules à l’aide d’une pince. Appuyez doucement sur la vitre de protection pour éliminer les bulles d’air.