Centrifugation à gradient de densité : une méthode pour isoler les cellules de la LLC du sang périphérique

Abstract

Source : Hay, J. et al. Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphoïde chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique d’isolement des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) du sang périphérique. Avec ce protocole, nous isolerons les cellules de la LLC à partir d’échantillons de sang de patients humains pour une génération efficace ultérieure de fractions nucléaires et cytoplasmiques.

Protocol

1. Isolement des cellules de la LLC à partir d’échantillons de sang de patients

1. Les échantillons de sang périphérique de patients atteints de LLC précédemment consentis sont reçus de la clinique dans des tubes de prélèvement sanguin EDTA, accompagnés de la numération des globules blancs (WCC). Purifier les échantillons de LLC dans le sang périphérique conformément au COE. Pour les WCC < 40 x 10⁶ cellules/mL, passez à l’étape 1.1.1 ; pour les WCC ≥ 40 x 10⁶ cellules/mL, passer à l’étape 1.1.2.
   1. Versez le contenu de tous les tubes sanguins EDTA dans un tube à centrifuger conique de 50 ml et ajoutez 50 μL de cocktail d’enrichissement des cellules B humaines pour 1 ml de sang. Incuber à température ambiante (RT) pendant 20 min. Passez à l’étape 1.1.2.
   2. Diluer l’échantillon dans un rapport de 1:1 avec le tampon de lavage RT CLL (solution saline tamponnée au phosphate (PBS), sérum de veau fœtal à 0,5 % (FBS) et EDTA à 2 mM).
2. Aliquote RT dans un tube à centrifuger conique de taille appropriée pour l’échantillon (10 mL dans un tube de 50 mL pour 30 mL d’échantillon ou 4 mL dans un tube de 15 mL pour 10 mL d’échantillon).
3. Superposer soigneusement l’échantillon sur le milieu à gradient de densité et centrifuger à 400 x g pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Assurez-vous que la centrifugeuse est à RT avant de placer les échantillons dans la centrifugeuse, car un changement de température entraînera un faible enrichissement des cellules mononucléaires, et désactivez le frein de la centrifugeuse, car un freinage brusque peut perturber l’interface liquide.
4. Récoltez doucement la couche blanche de cellules mononucléées qui s’accumulent à l’interface du milieu à gradient de densité et du tampon de lavage CLL, dans un tube à centrifuger conique frais de 50 ml à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.
5. Ajouter 40 mL de tampon de lavage CLL à la monocouche isolée pour laver les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à RT.
6. Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension en donnant un coup au fond du tube, puis répétez l’étape de lavage décrite à l’étape 1.5.
7. Jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension comme décrit à l’étape 1.6, puis remettre la pastille en suspension dans un volume déterminé de tampon de lavage de la LLC (jusqu’à 40 mL, selon la taille de la pastille de cellule).
8. Comptez les cellules à l’aide de bleu de trypan et d’un hémocytomètre. Procédez ensuite à la cytométrie en flux pour vérifier la pureté des cellules LLC.
   REMARQUE : À ce stade, les cellules de la LLC peuvent être cultivées à une concentration de 10 x 10⁶ cellules/mL dans des milieux destinés à être utilisés dans des expériences, et/ou cryoconservées dans du sulfoxyde de diméthyle à 10 % (DMSO)/FBS pour des travaux futurs à des concentrations allant jusqu’à 100 x 10⁶ cellules/flacon.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube de 15 mL	Biographie de Griener	188271
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Biographie de Griener	616201
Dmso	sigma	D2650
Edta	sigma	Eds
Sérum fœtal bovin	Thermopêcheur	10500064
Média à gradient de densité Histopaque1077	sigma	N° H8889
Trypan Blue Solution	Thermopêcheur	15250061
Comprimés PBS	Fisher Scientific	BR0014G
RosetteSep Cocktail d’enrichissement des lymphocytes B humains	Technologies des cellules souches	Référence 15064
Sigma 3-16P	SciQuip		centrifugeuse