1. Préparation de fractions subcellulaires à partir de cellules LLC
REMARQUE : Lors de la planification de la configuration expérimentale, incluez un puits de cellules non stimulées/non traitées à partir desquelles l’extrait cellulaire entier peut être généré.
- Effectuer la stimulation et/ou le traitement médicamenteux souhaité de la lignée cellulaire de la LLC MEC1 ou des cellules primaires isolées de la LLC en utilisant 10 – 20 x 106 cellules/condition. Les cellules seront ensuite utilisées pour le fractionnement subcellulaire ou pour générer un extrait de cellule entière, comme expliqué ci-dessous :
- Préparation des solutions/tubes : Préparez toutes les solutions/tampons fraîchement le jour du fractionnement avant que les cellules ne soient récoltées. Conservez les solutions sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin et utilisez-les dans les 4 heures suivant la préparation.
- Solution d’inhibiteur de PBS/phosphatase : Préparez les inhibiteurs de la phosphatase dans le PBS en diluant les inhibiteurs de la phosphatase 1:20 dans 1x PBS (c’est-à-dire 0,5 mL d’inhibiteurs de la phosphatase dans 9,5 mL de 1x PBS).
note: Assurez-vous que les inhibiteurs de la phosphatase n’ont pas précipité. En présence d’un précipité, chauffer à 50 °C pendant 10 min.
- Tampon hypotonique : Préparez 1 tampon hypotonique en diluant 1:10 de 10 tampon hypotonique dans de l’eau distillée (c’est-à-dire 50 μL de 10 tampons hypotoniques dans 450 μ L de dH2O).
- 10 mM de dithiothréitol (DTT) : Préparer 10 mM de DTT en faisant une dilution de 1:100 de 1M de DTT avec de l’eau distillée (c’est-à-dire 10 μL de 1 M de DTT dans 990 μL de dH2O).
note: La DTT est très labile, alors préparez-la à chaque fois. Évitez les cycles répétés de gel/dégel.
- Tampon de lyse complet : Déterminez la quantité de tampon requise pour chaque expérience. Chaque échantillon nécessite 50 μL de tampon de lyse complet, alors ajoutez 5 μL de DTT 10 mM à 44,5 μL de tampon de lyse, puis ajoutez 0,5 μL de cocktail inhibiteur de protéase. Cette quantité peut être augmentée en fonction du nombre d’échantillons dans l’expérience.
- Étiquetez quatre ensembles de tubes de microfuge de 1,5 mL pour chaque stimulation et/ou traitement médicamenteux pour les cellules fraîchement stimulées, les fractions cytoplasmiques fraîchement générées, les fractions nucléaires fraîchement générées et les lysats de cellules entières. Pré-refroidissez ces tubes de microfuge sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Transférez les cellules dans des tubes de microfuge et des pastilles de 1,5 mL étiquetés individuellement par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL d’inhibiteurs de PBS/phosphatase glacés. Granuler les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et maintenir les granules cellulaires sur de la glace.
- Préparation des fractions cytoplasmiques : Remettre doucement en suspension les pastilles cellulaires à utiliser pour le fractionnement subcellulaire dans 50 μL de 1x tampon hypotonique. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min pour permettre aux cellules de gonfler.
note: Le volume de tampon hypotonique utilisé peut être augmenté empiriquement en fonction du nombre de cellules.
- Ajouter 0,8 à 2,5 μL (1:20 à 1:60) de détergent dans chaque échantillon et utiliser le tourbillon sur le réglage le plus élevé pendant 10 s.
- Pour déterminer la concentration optimale de détergent à utiliser pour un type de cellule spécifique afin d’isoler les fractions nucléaires et cytoplasmiques, effectuez initialement un gradient de détergent. Une plage de 1:20 à 1:60 (c.-à-d. de 2,5 μL à 0,8 μL de détergent dans 50 μL de tampon hypotonique) devrait être adéquate.
note: Si le volume de tampon hypotonique à l’étape 3.4 est ajusté, assurez-vous que le rapport de détergent approprié est maintenu.
- Vérifiez la lyse cellulaire en observant les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase avant et après l’ajout de détergent. Les cellules entières semblent plus grandes avec un noyau dense et sombre. Le cytoplasme apparaîtra comme un halo brillant autour du noyau.
note: La lyse appropriée est confirmée en utilisant le Western blot pour analyser des protéines spécifiques dans les fractions lysées générées par le gradient de détergent.
- Une fois lysés, centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
- Transférez soigneusement le surnageant dans un tube de microfuge pré-refroidi et étiqueté. Cette fraction cytoplasmique peut être stockée à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour une analyse plus approfondie. Le reste contient la fraction nucléaire.
note: Évitez les cycles répétés de congélation/décongélation des échantillons.
- Préparation des fractions nucléaires : Remettre en suspension chaque pastille nucléaire dans 50 μL de tampon de lyse complet par pipetage de haut en bas.
REMARQUE : Le volume du tampon de lyse complet peut être ajusté empiriquement en fonction du nombre de cellules de départ.
- Ajouter 2,5 μL de détergent pour solubiliser les protéines associées à la membrane nucléaire et au vortex au réglage le plus élevé pendant 10 s. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 30 min.
- Vortex sur le réglage le plus élevé pendant 30 s, puis centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
- Transférez le surnageant dans un tube microfuge pré-refroidi et étiqueté. Cette fraction nucléaire peut être stockée à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour une analyse plus approfondie.
note: Évitez les cycles répétés de congélation/décongélation des échantillons.
